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letzter Beitrag von Bernhard am

DNA Sequenzierung: Erschwinglich für jedermann?

  • Grüß euch!


    Angeregt durch den Thread "Perlpilz ohne rot" und durch die Ankündigung den Pilz bei Pablo Alvarado sequenzieren zu lassen, habe ich gegoogelt und bin auf der Seite von Herrn Alvarado gelandet.

    Der spanische Mykologe führt DNA Analysen durch. Bei der Preisliste (alvalab.es - Pedidos) sind mir fast die Augen aus dem Kopf gefallen.

    Ich dachte bisher immer dass solche Analysen sehr teuer sind. Ich habe zwar keine Ahnung, welche Arbeitsschritte genau erforderlich wären wenn ich einen Beleg dorthin senden würde, aber wie auch immer, es ist leistbar.

    (Das soll keine Werbung sein, es gibt sicher jede Menge anderer Labors mit ähnlichen Preisen.)


    Nun meine Fragen an die Experten hier:

    Was wird genau gemacht beim Sequenzieren?

    Wie kann ich mir eine DNA Extraktion vorstellen?

    Wie läuft das ganze ab?


    Ist das ganze wirklich schon so einfach und günstig geworden dass es sich jeder leisten kann mal einen Pilz analysieren zu lassen?

    Oder hab ich einen Denkfehler?


    LG Bernhard

  • Hallo Bernhard,


    Was genau willst du denn wissen? Was zu beachten ist, wenn du selbst etwas zum Sequenzieren weggeben willst, also was du zum Labor schickst und was du von dort zurückbekommst?


    Oder geht es dir eher darum, was für Schritte dann im Labor mit deiner Probe passieren?


    LG, Craterelle

  • Hallo Craterelle!


    Alles will ich wissen ;)


    Wenn ich einen Fruchtkörper untersuchen lassen würde: Was müsste ich beachten wenn ich ihn zum Labor schicke? Einfach nur trocknen?

    Was macht dann das Labor damit? Wie läuft so eine Sequenzierung ab? Und was bekomme ich zurück als Ergebnis?


    LG Bernhard

  • Hallo Bernhard,


    Es gibt hier ganz sicher einige, die schon wesentlich mehr Erfahrung damit haben. Ich bereite gerade erst meine erste Sequenzierung vor. Was mir dazu zur Probenentnahme mit auf den Weg gegeben wurde: zügig trocknen, aber auf keinen Fall über 40 Grad. Unbedingt Kontamination mit anderem biogenen Material (Fremdsporen, Schimmel u.ä.) vermeiden.


    Das, was im Labor passiert, hatte ich mal versucht so in etwa für mich vorstellbar zu machen. Es ist ein länglicher Thread geworden und liest sich wahrscheinlich etwas zäh, weil ich mir die Zusammenhänge (soweit ich sie durchschaut habe) erst nach und nach erarbeitet habe.

    Gensequenzierung - wissenswertes?


    Heraus bekommst du dann bei Pablo Alvarado auf jeden Fall eine sog. AB1-Datei. Das sind meiner Kenntnis nach die Chromatogramm-Rohdaten, die mit entsprechender Software betrachtet etwa so aussehen dürften, wie Florian das in obigem Thema gepostet hatte:

    https://www.pilzforum.eu/attac…sequenzierungsfehler-png/


    Für einen geringen Aufpreis erhältst du auch noch die Sequenz, also die Buchstabenabfolge.


    Vielleicht hilft das ja schon ein wenig.


    LG, Craterelle

  • Was mir dazu zur Probenentnahme mit auf den Weg geben wurde: zügig trocknen, aber auf keine Fall über 40 Grad.

    Das geht prima in Ethanol 100% (absolut, unvergällt ), am besten über eine Verdünnungsreihe. Dann fällt das Temperaturproblem weg. Entomologen nehmen soviel ich weiß 70-80% , um ein Kollabieren morphologischer Strukturen zu verhindern, aber um die geht es ja hier nicht. Dann könnte man die Probe auch in einem verschraubten Röhrchen kontaminationssicher auf den Weg bringen.

  • Unbedingt Kontamination mit anderem biogenen Material (Fremdsporen, Schimmel u.ä.) vermeiden.

    Wenn das Verfahren wirklich keinerlei Kontaminationstoleranz hat, stelle ich mir das sehr schwierig vor. Auf der sichersten Seite wäre man, wenn man die Probe steril entnimmt.


    Machbar wäre das z.B. so: Man kauft sich eine größere, durchsichtige Lagerbox (20l oder mehr) und schneidet an einer längeren Seite zwei Löcher für die Hände ein. Die Box stellt man mit der Öffnung nach unten auf eine glatte saubere Oberfläche und nebelt innen alles mit Desinfektionsmittel (besonders sicher wäre etwas auf Hypochloritbasis) ein. Nach ein paar Minuten Wartezeit zieht man sich Nitrilhandschuhe an, desinfiziert diese mit einem Handfesinfektionsmittel, schnappt sich den Stiel des zu untersuchenden Pilzes, wischt ihn auch oberflächlich mit alkoholischem Desinfektionsmittel ab und legt ihn in die Box. Hände erneut desinfizieren und in der Box den Pilzstiel vorsichtig auseinanderreißen/brechen. Die quasi sterilen Bruchflächen nicht berühren und mit einer vorher über dem Bunsenbrenner ausgeglühten Pinzette ein Stück Plectenchym aus der Mitte entnehmen und in ein steriles Gefäß überführen.

    So habe ich es geschafft, Pilze auf Agarmedien nahezu kontaminationsfrei zu klonen.


    Ob das für PCR unbedingt so steril sein muß? Die KTU-Leute entnehmen ja auch Probenmaterial aus Nase und Mund und das sind ja bekanntlich sehr lebendige Biotope<X


    Liebe Grüße

    Ralph

  • Danke, Ralph. Ob die Labore auch in Ethanol konservierte Proben annehmen weiß ich nicht. Ich hatte den Eindruck, dass Trocknen das übliche Verfahren wäre, aber ich weiß eben insgesamt noch nicht sehr viel.


    Tatsächlich steril muss es wohl auch nicht sein, nur eben so sauber wie möglich. Nachdem, was ich gehört habe, wird zum Sequenzieren dann im Labor nur ein Teil der Probe steril entnommen (was unter Laborbedingungen sicher einfacher ist als Zuhause).


    Fremdsporen und alles außen anhaftete stelle ich mir auch weniger störend vor als Schimmel, der möglicherweise die gesamte Probe durchzieht. Und das ergäbe dann eine Mischung aus den ITS-Sequenzen zwei verschiedener Organismen, was die Ergebnisse wertlos machen dürfte.

  • Ob die Labore auch in Ethanol konservierte Proben annehmen weiß ich nicht. Ich hatte den Eindruck, dass Trocknen das übliche Verfahren wäre, aber ich weiß eben insgesamt noch nicht sehr viel.

    Hallo Craterelle,

    ein Bekannter von mir ( Dipterologe bei Zool. Staatssammlung München) benutzt seit etlichen Jahren nur noch reines, unvergälltes Ethanol als Lager- und Konservierungsmedium, da Vergällungsmittel wie MEK oder Benzin die Sequenzierbarkeit verhindern. Daraus ziehe ich den Umkehrschluß, daß Ethanol schon gehen würde.

    Mir erschiene das halt praktischer. Kleine Probe in 50% Ethanol spülen, dann für 10 min. in Ethanol 70% überführen, und von da zur Lagerung in 80-100% geben, zuschrauben und „Ab die Post“.

    Wenn Du eh mal Kontakt zum Sequenzierer aufnimmst, kannst Du ja beiläufig fragen, das würde mich auch sehr interessieren.


    Liebe Grüße

    Ralph

  • Grüß euch!


    Danke an Schupfnudel und Craterelle für die Links! Sehr interessant, aber ich hab bisher alles nur mal so quergelesen. Ich muss das alles wohl noch intensiver durcharbeiten.

    Auch danke an Hassi für die Beiträge zur Konservierung.


    So, und nun spielen wir das Ganze einmal in einem Gedankenexperiment durch...


    Ich mache ein Exsikkat unter 40°C oder packe eine Probe in Ethanol.

    Dann ab damit ins Labor.


    Im Labor wird die DNA extrahiert (7,50 EUR).


    Dann wird eine PCR gemacht? Wozu genau das vervielfältigen? Das habe ich noch nicht verstanden. (ca. 3 EUR)


    Dann sequenzieren (6 EUR).


    Anschließend ein Sequenz-Alignment. Man versucht also die Sequenzen so auszurichten dass sie bestmöglichst zueinander passen.

    Was soll hier verglichen werden? Wird mehrmals sequenziert und ein Alignment gemacht um Messfehler zu kompensieren? Oder wird nur eine Sequenzierung gemacht und gleich mit Daten aus Datenbanken verglichen? (0,5 EUR)


    Anschließend wird eine Phylogenetische Analyse (0,25 EUR) gemacht um die Daten in ein Verwandtschaftsverhältnis zu bekannten Sequenzen zu rücken. Um 0,5 EUR gibts dann eine Darstellung in Baumform.


    Somit könnte man für ca. 18 EUR seinen Fund genetisch untersuchen lassen.

    Ist das so ungefähr richtig?


    LG Bernhard

  • Hallo Bernhard,


    So wie ich mir den Ablauf vorstelle, brauchst du Schritt 1, um die DNA von den restlichen Zellbestandteilen zu trennen.


    Durch die gezielte Vervielfältigung eines bestimmten DNA-Abschnitts (Schritt 2, bei Basidiomyzeten oft der ITS-Region) isolierst du dann diesen daraus, denn die gesamte DNA möchtest du ja gar sequenzieren (oder möchtest vielleicht, aber das wäre vermutlich deutlich teurer). Dieser Schritt war in einem der im obigen Thema verlinkten Dokumente recht anschaulich erklärt, meine ich*.


    Die eigentlich Sequenzierung, Schritt 3, ist für mich noch am ehesten die Blackbox bei der ganzen Sache.


    Alle anschließenden Schritte könntest du im Prinzip auch selbst machen, weil dafür ja kein Labor mehr nötig ist.


    LG, Craterelle


    * Das hier ganz unten verlinkte PDF meinte ich:

    Wie funktioniert Sequenzierung?

  • Wenn Du eh mal Kontakt zum Sequenzierer aufnimmst, kannst Du ja beiläufig fragen, das würde mich auch sehr interessieren.

    Hallo Ralph, ich habe zur Antwort bekommen, dass Proben in Ethanol auch angenommen würden, aber dass das zu 1-2 Tagen Zeitverzögerung führen könnte, weil sie sie dann erst trocknen müssten. Warum das nötig ist, schrieb er nicht, aber ich könnte mir vorstellen, dass sie das Trockengewicht brauchen, um die Menge der benötigten Primer etc. zu berechnen. Natürlich nur eine Hypothese...


    LG, Craterelle

  • Hallo Craterelle,


    danke für die Info! Ich mach das dann in Zukunft so, daß ich von Pilzen die interessant und nicht eindeutig bestimmbar sind, gleich provisorisch ein Eckchen einschnapse.

    Ich hab zwar auch in Praktika PCR gemacht und Arabidopsis-Gene sequenziert aber das ist dreißig Jahre her. Da gibt es also noch viel Neues zu lesen für mich :/

    Schön, dass es hier auch für sowas eine Community gibt.


    Liebe Grüße

    Ralph

  • Hallo Craterelle!

    * Das hier ganz unten verlinkte PDF meinte ich:

    Wie funktioniert Sequenzierung?

    ==Pilz23Danke!


    Wirklich ein super Artikel über die PCR!


    Der Artikel oben im genannten BMG-Forum-Thread dürfte auch sehr interessant sein.

    Ich muss ihn aber erst lesen.

    (PDF) Methodik und Anwendung von DNA-Analysen in der Pilz-Taxonomie


    Hallo Ralph!

    Ich finde es auch schön dass hier solche Themen einen Platz haben.

    Auch wenn ich da erst einsteige mit meinen Recherchen, ich finde es mega interessant.


    Außerdem finde ich es wirklich faszinierend, dass so eine relativ neue Technik bereits so leicht verfügbar und preiswert für jeden zu nutzen ist.


    LG Bernhard

  • Hallo Ralph, Arabidopsis musste ich auch erstmal nachschlagen. Dann bist du Biologe?


    Bernhard, eigentlich finde ich es auch sehr positiv, dass die Technik in der Breite, also auch für Laien, verfügbar ist. Indes habe ich bisher ein wenig das Gefühl, dass es noch an Grundlagenforschung fehlt (und das dürfte absolut nicht an der Verfügbarkeit für Laien liegen, sondern eher an der insgesamt schnellen und vielleicht auch etwas unkritischen Einführung).


    Nach wie vor wundere ich mich z.B., dass mit irgendeiner Grenze für einen Artrang hantiert wird, es aber keinerlei systematische Untersuchungenn dazu zu geben scheint.


    Aber vielleicht existiert so etwas ja doch?


    LG, Craterelle

  • Wenn Du eh mal Kontakt zum Sequenzierer aufnimmst, kannst Du ja beiläufig fragen, das würde mich auch sehr interessieren.

    Hallo Ralph, ich habe zur Antwort bekommen, dass Proben in Ethanol auch angenommen würden, aber dass das zu 1-2 Tagen Zeitverzögerung führen könnte, weil sie sie dann erst trocknen müssten. Warum das nötig ist, schrieb er nicht, aber ich könnte mir vorstellen, dass sie das Trockengewicht brauchen, um die Menge der benötigten Primer etc. zu berechnen. Natürlich nur eine Hypothese...


    LG, Craterelle

    Hallo zusammen,


    In Ethanol kann DNA ausfallen, das würde dann Probleme bei der Extraktion der DNA aus aus dem Pilzgewebe verursachen. Deswegen muss nach Möglichkeit der Ethanol vor der Extraktion abdampfen.


    Liebe Grüße,

    Florian

  • Hallo,

    ich hab im vergangenen Jahr Pilz-DNA extrahiert und dazu wurden getrocknete Pilze verwendet, also Belege. Am besten geeignet sind junge Pilze und von denen, sofern groß genug, nur die Fruchtschicht. Man muss die Proben so gut wie möglich von Schmutz befreien, auf keinen Fall darf Schimmel an den Pilzen sein, denn Schimmel-DNA ist offensichtlich stärker als die Pilz-DNA. Man kann auch Frischmaterial extrahieren, muss dazu dann halt mehr Material in ein Eppi geben. Wie gesagt, sehr wichtig ist, dass die Pilze jung sind, man kann fast sagen je jünger je besser. Bei der Probenentnahme muss man sehr steril arbeiten, d.h. die Pinzette wird vor der Benützung entweder mit Ethanol gereinigt oder abflambiert. Auch die Fenster und Türen müssen geschlossen sein, um zu verhindern, dass Fremdmaterial ins Eppi wandert.

    LG

    romana

    103-15 APR2017+17(3.Platz)+2(Wette)=107-1(OBR)-15 APR2018=91+13(3.Platz)+8(Wetten)=112-2+7(Wette)=117-15 APR2019=102+8(8.Platz)=110-15 APR2020=95

  • Hallo Craterelle,

    das sind die kleinen Röhrchen mit Deckel, in die man die Proben gibt und in denen auch die Extraktion durchgeführt wird. Zuerst kommen die Proben in ein Spitz-Eppi (unten spitz) mit kleinen Glaskugeln, dann in die Mühle. Danach beginnt die Extraktion, zum Ende wird die Extraktionslösung gefiltert - in einem Filter-Eppi, von dem man den Filter dann abnehmen kann. Der Filter wird dann ausgewaschen, d.h. man gibt eine Lösung hinzu und steckt den Filter wiederum in ein Eppi und ab in die Zentrifuge - und fertig ist die Extraktionslösung.

    Ich konnte maximal 24 Proben auf einmal bearbeiten, das ganze Prozedere inklusive Foto (auf dem man sieht, ob die Extraktion funktioniert hat) dauert ca. einen Arbeitstag.

    LG

    romana

    103-15 APR2017+17(3.Platz)+2(Wette)=107-1(OBR)-15 APR2018=91+13(3.Platz)+8(Wetten)=112-2+7(Wette)=117-15 APR2019=102+8(8.Platz)=110-15 APR2020=95

  • Das hat mich jetzt auch interessiert, weshalb ich gegoogelt habe:


    Die Mikroreaktionsgefäße der Größen 1,5 ml und 2 ml werden im deutschsprachigen Laborjargon als Eppi bezeichnet. Im englischen Sprachraum werden diese Mikroreaktionsgefäße als Eppendorf tube bezeichnet. Die Bezeichnung Eppi bzw. Eppendorf tube ist international ein generalisierter Markenname geworden, wobei sich nicht der Name der Produktmarke (wie die deutschsprachige Verwendung von Tempo für Papiertaschentücher oder Tesa für Klebestreifen), sondern die Abkürzung der Marke des Unternehmens eingebürgert hat.


    Wieder was Neues gelernt...

    LG

    romana

    103-15 APR2017+17(3.Platz)+2(Wette)=107-1(OBR)-15 APR2018=91+13(3.Platz)+8(Wetten)=112-2+7(Wette)=117-15 APR2019=102+8(8.Platz)=110-15 APR2020=95

  • Hallo zusammen,

    da ihr ja auch durch meinen Post mit dem "Perlpilz ohne rot " auf das Thema gekommen seit, schildere ich mal meine Erfahrungen mit AlvaLab, der Firma von Pablo Alvarado
    Ich habe schon desöfteren Proben dort sequenzieren lassen
    Einfach ein kleines Stück des Pilzes möglichst frisch nach dem Sammeln trocknen , am besten mit Fruchtschicht und ohne anhaftenden Dreck / Moos usw.

    Dabei die Temperatur gering halten und wirklich gut durchtrocknen.
    Dann die Proben in Plastik Zip-Beutel geben und beschriften
    Die Sendung per EMail bei Alvalab ankündigen und per Post nach Spanien schicken

    Nach 2 - 3 Wochen bekommt man eine EMail mit den Ergebnissen.
    Im kostengünstigsten Fall bekommt man eine AB1 -Datei zu jeder Probe, ( Rohdaten der Sequenzierung)

    Die kann man mit freier Software ( z.B. MEGA X) öffen und in ein FASTA file konvertieren
    Das FASTA - file enthält die Gen-Sequenz als Folge der Basen-Paare G A T C

    Diese File können direkt bei den Gendatenbanken UNITE ( nur für Pilze) oder GENBANK ( allgemein) eingelesen werden.
    Ein Analyse der Daten spukt dann die ähnlichste, bereits gespeicherten Sequenzen aus.
    Jetzt brauchte es etwas Erfahrung , die Ergebnisse zu beurteilen.
    Viele Sequenzen in der Datenbank sind namenlos oder von Übersee usw.
    Taucht ein Artname auf sollte man prüfen vom wem die Art bestimmt wurde , ich persönlich würde nur einem bekannten Gattungsspezialisten trauen
    Optimal ist wenn die eigene Sequenz dem Typus-Beleg zu 99 -100% gleicht.
    Das Prozeder klingt schwieriger wie es wirklich ist, am besten man hat aber jemand an der Hand der sich etwas auskennt.

    Die Brutto - Kosten einer solchen Sequenzierung bei Alvalab liegen bei etwas über 20 € , da die Preise auf der Homepage noch keine MwSt. enthalten

    Natürlich kann eine Sequenzierung auch scheitern, wenn das Material fehlerhaft ist
    Ich hatte aber bisher eine Erfolgsquote von 95%

    Ich hoffe das hilft etwas.
    Die komplette Sequenzierungsprozedur zu beschreiben ist in einem solchen Thread nicht möglich
    Ausserdem bin ich Laie, kein Biologe und damit reiner Anwender


    beste Grüße

    Uwe

  • Grüß euch!


    @ Uwe

    Danke für deine Schilderungen aus der Praxis!

    Es läuft also tatsächlich so unkompliziert wie ich mir das vorgestellt habe. Für ein paar Euro mehr könnte man sich auch den Vergleich mit Datenbanken noch dazukaufen.



    Ich finde das alles nach wie vor faszinierend. Sowohl aus Anwendersicht (so unkompliziert und günstig) als auch aus wissenschaftlicher Sicht (da werde ich mich weiter einlesen, aber als Wirtschaftsingenieur und Nicht-Biologe sicher nicht alles verstehen).


    LG Bernhard

  • Hi,


    irgendwie interessant/spannend, dass viele von euch mit Begriffen, wie Eppendorf-Tubes und Arabidopsis etc. nix anfangen könnt. Ich bin mit diesen Begriffen durch mein Studium quasi "aufgewachsen" und es sind für mich Selbstverständlichkeiten geworden diese Begriffe auch zu verwenden. Ebenso selbstverständlich ist das für mich, dass ich das auch von anderen erwarte.


    Danke schon mal für die Erinnerung an dieser Stelle. Leider fehlen mir aktuell die Zeit und die Nerven mich hier mit einzubringen. Dazu steht gerade bei mir viel zu viel anderes auf dem Plan. Die Hauptsaison, inkl. Tagungssaison hat begonnen.


    Ich halte dieses Jahr einen Vortrag auf der Boletus-, bzw. Sachsentagung wo ich die Tücken der molekularen Pilzbestimmung am Beispiel der Gattung Leccinum aufzeige.


    l.g.

    Stefan

    Risspilz: hui; Rissklettern: bisher pfui; ab nun: na ja mal sehen...


    Derzeit so pilzgeschädigt, das geht auf keine Huthaut. :D


    Meine Antworten hier stellen nur Bestimmungsvorschläge dar. Verzehrsfreigaben gibts nur vom PSV vor Ort.

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