DNA-Sequenzierungen

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1. offizieller Beitrag

    Hallo zusammen,


    wie im Titel schon beschrieben, wird nach einem Labor, Institut oder dergleichen gesucht das Auftragsarbeiten im Bereich der DNA-Sequenzierung bei Pilzen anbietet.
    Wenn hier jemand Anlaufstellen kennt, wenn möglich auch gleich noch mit einem Ansprechpartner, würden wir uns sehr freuen.


    Antonius behüt und herzliche Grüße
    Frank

    Hallo Frank,



    hier: https://www.nw-fva.de/index.php?id=141 (also die Adresse in Hannoversch-Münden!) werden genetische Untersuchungen an Bäumen durchgeführt. Ich hatte im Rahmen des Forschungsprogramms "Wildapfel" mal einen sehr freundlichen telefonischen Kontakt. Ob die auch Pilze sequenzieren, weiß ich nicht, könnte mir aber gut vorstellen, daß Du dort erfahren kannst, wer das macht.



    Schöne Grüße



    Feinschmecker

    Hallo an alle,


    für Pilz-Sequenzierungen im Hobby-Bereich hat sich Pablo Alvarado in Spanien (alvalab.es) als zuverlässiger, freundlicher und preisgünstiger Partner qualifiziert.


    Er spricht gut englisch, und übernimmt auch die Nacharbeit des Vergleiches mit Genbank. Die meisten Labore schicken einem die Daten des Chromatogramms, oder bestenfalls den Buchstabensalat der Basensequenzen, und erwarten vom Empfänger, dass er schon weiß, was das bedeutet.


    Gruß,
    Wolfgang



    Hallo Wolfgang,


    die Preise von Pablo sind wirklich günstig. Ich würde ihm gerne mal ein Exsikkat schicken. Leider kenne ich mich mit den Fachausdrücken in seiner Preisliste nicht aus. Kannst du mir verraten, was genau ich bei ihm ordern muss, um, ausgehend vom Exsikkat, die Basensequenz und den phylogenetischen Baum zu erhalten?


    Herzliche Grüße


    Bernd

    Hallo Bernd,


    ich bin zwar nicht Wolfgang, aber vielleicht kann ich dir trotzdem helfen.


    Wenn du ein Exsikat sequenzieren lassen möchtest, dann musst du zuerst die DNA extrahieren (lassen). Hier hast du laut Homepage zwei Optionen, du kannst das mittels Kit (das sind üblicherweise spezielle Säulchen, mittels derer die DNA von Verunreinigungen wie Proteinen befreit wird) oder über ein günstigeres Protokoll machen lassen. Macht halt preislich einen Unterschied, am Ende vielleicht auch einen in der Qualität der Sequenz.


    Der zweite Schritt ist dann die Vervielfältigung des gewünschten Abschnittes der DNA mittels PCR. Da hast du auch wieder drei verschiedene Optionen. Die Taq-Polymerase ist günstig, macht aber rein statistisch alle paar tausend Basenpaare einen Fehler, sprich eventuell ist am Ende eine Base in deiner Sequenz falsch. Die HiFi-Taq ist teurer, hat aber eine Korrekturfunktion, wodurch die Fehlerrate deutlich gesenkt wird. Es wird also während der Vervielfältigung geprüft, ob die Reihenfolge der Basen korrekt ist. Die PCR-beads habe ich selbst noch nie verwendet, die sollen nochmal robuster und fehleranfälliger sein. Da ich noch nicht damit gearbeitet habe, weiß ich allerdings nicht, ob sich da der Aufpreis für dich lohnt.


    Im dritten Schritt wird der Abschnitt entweder sequenziert, oder nach einer Reinigung sequenziert. In der Reinigung wird der vervielfältigte DNA-Abschnitt von der Polymerase aus der PCR, sowie Salzen und weiteren Bestandteilen gesäubert, was sich positiv auf die Qualität der erhaltenen Sequenz auswirkt. In der Sequenzierung wird dann die Abfolge der DNA-Basen ermittelt.


    Ab dem Schritt könnte man dann die Sequenz selbst analysieren. Wenn du den Baum haben möchtest, dann solltest du noch Sequence editing (da wird die Sequenz nochmal gecheckt und mögliche Fehler korrigiert) und Phylogenetic tree figure wählen. Nicht ganz klar ist mir, was du bei der Option der phylogenetischen Analyse an Daten geschickt bekommst, das können dir vielleicht Wolfgang oder Anbieter beantworten. Diese Schritte könnte man allerdings mit etwas Erfahrung auch selbst machen, da diese Arbeit am Computer stattfindet.


    Fazit: Du brauchst auf jeden Fall die drei Schritte "DNA Extraction", "PCR amplification" und "Sequencing", wobei du da verschiedene Optionen hast, die Einfluss auf die Qualität der Sequenz haben (können). Ob du für die Erstellung des Bäumchens die phylogenetische Analyse dazubuchen musst, oder ob das dann in den 20 Euro dabei ist, das kann ich dir leider nicht beantworten.


    Liebe Grüße,
    Florian

    Hallo Florian und Wolfgang,


    noch ein paar Detailfragen:


    a) Wird eigentlich immer die ITS-Sequenz genommen?
    b) Welche Methode sollte man für den phylogenetischen Baum wählen, ML?
    c) Sind 45 Grad beim Gewinnen der Exsikkate eigentlich ok, oder ist die Temperatur für spätere Sequenzierung schon zu hoch?


    Herzliche Grüße - und vielen Dank!


    Bernd


    Hallo Bernd,


    zu a) Das hängt von der Gattung ab. Für viele Gattungen ist die ITS super geeignet, für manche nur schlecht und manche Gattungen erfordern die Sequenzierung von mehreren Bereichen. Eventuell kann ich dir weiterhelfen, wenn ich weiß, welche Gattung dein Fund betrifft und welche Art du vermutest, bzw. ob es eine unbeschriebene Art sein könnte (gerne auch per PN, falls du das hier nicht schreiben möchtest).


    zu b) Kann ich dir leider nichts sagen, das mache ich nicht selbst (bzw. nur sehr amateurhaft).


    c) 45 Grad passen gut :thumbup: .


    Liebe Grüße,
    Florian



    Hallo Florian,


    es geht um Russula und evtl. Lactarius/Lactifluus. Beginnen möchte ich mit Russula pallidospora.


    Liebe Grüße


    Bernd

    Hallo,


    heute habe ich für einen Täubling bei Pablo Alvarado in Spanien (alvalab.es) die DNA-Sequenzierung inkl. des Phylogenetischen Baumes bestellt. Bin sehr gespannt, was dabei rauskommt!


    Zukünftig möchte ich nur noch die Basensequenz erstellen lassen und den Rest am PC selber machen.
    Wer kann mir dabei weiterhelfen? Welche freien Programme und Genbanken gibt es bzw. kann man empfehlen?


    Jeder Tipp ist willkommen!


    L.G. - Bernd

    Hallo Bernd,


    So sehr viel weiterhelfen kann ich leider nicht. Die Wissenderen sind eingeladen, zu ergänzen und zu korrigieren.


    Den Schritt vom Chromatogramm zu den Basensequenzen kenne ich bisher gar nicht, finde ihn aber auch beachtenswert. Florian hatte dazu hier sehr erhellende Beispiele gegeben.


    Wenn du die Basenabfolge schon hast, bräuchtest du als nächstes Vergleichsmaterial aus den Gendatenbanken. Ich habe immer bei Unite gesucht. Hier würde ich dann Proben derselben Art aussuchen sowie noch weitere aus der Sektion oder Subsektion, außerdem noch etwas genetisch weit entferntes als "Outgroup" (das habe ich hier recht gut erklärt gefunden). Ob alles, was in den Datenbanken steht, auch korrekt benannt wurde, ist natürlich auch eine offene Frage. Ich würde mich wenn möglich auf die Sequenzen konzentrieren, die bei "Sequence Source" "Specimen" (übersetze ich hier hoffentlich richtig mit Fruchtkörper?) sowie eine externe Referenz aufgeführt haben. Ich meine, man kann alternativ auch automatisiert alle Proben mit größter Übereinstimmung heraussuchen lassen, aber dann weiß man noch weniger, wie zuverlässig die bestimmt wurden.


    Die zu vergleichenden Sequenzen dann ins FASTA-Format bringen, was mit einem beliebigen Texteditor ohne weiteres machbar ist.


    Für das Alignment der so vorbereiteten Sequenzen kann man auf Online-Tools wie MAFFT zurückgreifen. Generatoren für Baumdarstellungen sind auf der Ergebnisseite verlinkt.


    Ich würde mich freuen, wenn du weiterhin berichtest.


    Vielleicht magst du Chromatogramm und/oder Basensequenz der aktuellen Sequenzierung teilen? Dann könnte man mal schauen, ob ein derartiges Vorgehen in die Nähe des vom Profi erstellten Resultats kommt.


    LG, Craterelle



    Hallo Craterelle,


    danke für deine Hinweise, allmählich geht's voran.
    Man sollte sich Chromatogramm plus Basensequenzen bestellen, etwa 20,- Eur. für eine ITS-Sequenz.
    Ein paar Sequenzen von eigenen Russula-Funden besitze ich jetzt, habe in den vergangenen Tagen damit BLAST-Übungen durchgeführt und mit den Vergleichsergebnissen dann via MEGA 7 phylogenetische Bäume erstellt.
    Für mich als Hobby-Mykologen ist das schon sehr gewöhnungsbedürftig!


    Heute habe ich deine Vorschläge aufgegriffen und aus der Unite-Datenbank Sequenzen herauskopiert. Mit diesen dann MAFFT gefüttert und NJ-Trees erstellt. Hat eigentlich ganz gut funktioniert.


    Kannst du mir verraten, ob es eine elegante Methode gibt, die Unite-Sequenzen nach MAFFT zu übertragen? Meine Methode mit Copy und Paste der einzelnen Sequenzstränge ist ziemlich aufwändig!


    Herzliche Grüße
    Bernd


    Hallo Bernd,


    nein, da habe ich leider keine tollen Tipps. Ich kopiere auch ziemlich viel zwischen verschiedenen Programmen (Browser, Editor, manchmal Tabellenkalkulation) hin und her. Hilfreich finde ich, spätestens wenn die Datensätze etwas größer werden, eine guten Texteditor. Da kann man dann viele Schritte mit Suchen & Ersetzen gleich für alle machen anstatt einzeln von Hand.


    LG, Craterelle