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letzter Beitrag von Tuppie am

Die Technik hinter der Gefrierbrotschneidemaschine / Kryostat

  • Moin an alle!


    Ich wollte euch hier mal eine Spezialmethode vorstellen.

    Die Gefrierschnitttechnik am Kryostat.


    Der Verwendungszweck dieser Technik ist es, weiches, nichtfixiertes, oder vitales Gewebe zu schneiden.

    Die Schnittstärke kann von 0,001-0,05mm (1-50µm) variiert werden.


    1. auf dem Objekthalter, eine kleine Runde Metallplatte mit einem Schwalbenschwanz auf der Rückseite, wir etwas Medium gegeben

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    2. Die Probe wird ins Medium gestellt.

    35442980on.jpg


    3. Die Probe wird in den Kryostaten gestellt.

    35442981uj.jpg


    4. Bei -22 Grad gefriert das Medium und die Probe

    35442982hb.jpg


    5.Das Medium verfärbt sich von transparent zu weiß

    35442983ga.jpg


    6. Die Probe wird stetig mit Medium bedeckt, damit keine Luftblasen oder Lücken entstehen, zumal das Medium sehr flüssig ist (ähnlich Honig)

    35442984qs.jpg


    7. Komplett durchgefrorene Probe wird in den Beweglichen Teil des Kryostaten eingespannt.

    35442985tr.jpg


    8. Die Probe wird freigelegt und überschüssiges Material weggeschnitten.

    35442987mb.jpeg


    9. Das Gewebe und das feste Medium werden mit einem Pinsel vom Messer weg gezogen, während sich die Probe nach unten bewegt.

    Die Probe bewegt sich auf und ab, zudem je nach eingestelltem schritt nach vorne.

    ich versuche die Bewegung mal zu beschreiben. Probe einspannen, Probe bewegt sich von oben nach unten, dann von unten nach oben, dann ein schritt (zb. 10µm) nach vorne, dann nach unten... und so weiter

    35442989nu.jpg


    10. Der fertige Schnitt auf der schwarzen Fläche liegende schnitt wird mit einem !warmen! Objektträger abgenommen, dafür wird der Objektträger einfach schnell auf den Schnitt gelegt. Das Medium schmilzt sofort und der Schnitt klebt auf dem Objektträger.

    35442990dj.jpg


    11. Das Medium ist wasserlöslich und kann mit Wasser ausgewachsen werden.




    Ich hoffe euch hat diese kleine Technikexkursion gefallen und sie ist nachvollziehbar.


    Für Fragen bin ich natürlich immer offen!


    Schönes Wochenende euch allen!

    Alex

  • Hi Alex,


    feine Idee, Labortechniken vorzustellen ==Gnolm8

    Was jetzt fehlt, sind Mikrobilder des Ergebnisses. Außerdem eine anwendungsbezogene Beschreibung: wozu einen Dünnschnitt und weshalb am Kryostaten.

    Ich kann mir ehrlich gesagt nicht vorstellen, dass das Ergebnis hübsch wird. Die Probe einfach so wie du zeigst in DMSO einfrieren dauert so lange, dass dir unweigerlich riesige Eiskristalle deine Strukturen zerstören. Ich betreibe einigen Aufwand, um das zu vermeiden. Selbst die Probe in flüssigen Stickstoff werfen (-200 °C) reicht nicht. Wird zwar augenscheinlich sofort hart, es hatte sich aber kurz eine isoliernde Gasphase um die (warme) Probe gebildet. Dehalb muss man vorher noch durch ein anderes Medium wie z.B. Isopentan. Die lästige Hampelei besteht darin, dass man das auch in einem Gefäß mit Stickstoff kühlt, es aber schnell zu kalt oder zu warm wird. Wenn festgefroren, dann Mist.


    Warum also nicht gleich fixieren und in Paraffin einbetten? In der Immunhistochemie braucht man die Kryomethode, wie du schon angedeutet hast, wenn man Antigene nachweisen möchte, die durch eine Fixierung so verändert werden, dass man sie mit dem entsprechenden Antikörper nicht mehr nachweisen kann. Durch einige Tricks (Antigendemaskierung) ist es manchmal dennoch möglich. Wie dem auch sei, keine Anwendung für den Hobbymykologen.


    Was für die Kryomethode in der Mykologie sprechen könnte, wäre der Erhalt einiger Hypheninhaltsstoffe wie Öltropfen. Die würden natürlich bei der Entparaffinierung im Xylol rausgewaschen.


    Du kannst deine Kryoschnitte übrigens halbwegs fixieren, wenn du sie nach dem Trocknen 10 min in Isopropanol inkubierst. Dann verlierst du die Schnitte nicht so leicht beim anschließenden Färben ;)

  • Moin Drosophila,


    ich werde deinen text mal etwas zerpflücken um besser drauf einzugehen.

    Außerdem eine anwendungsbezogene Beschreibung: wozu einen Dünnschnitt und weshalb am Kryostaten.

    anwendungsbezogen in der Mykologie? Nun warum nicht... so kann man großflächig material untersuchen oder auch bestimmte Strukturen und Aufbau zu erkennen, was händisch teilweise sehr schwierig zu erreichen ist.

    In der Medizin:

    Wie du schon schriebst für Forschung zum Nachweis labiler Antigene oder Stoffe die nach der allgemeinen Entwässerung durch Alkohol und xylol nicht mehr vorhanden sind (Fettnachweis)

    In der Routine wird diese Technik zur Schnellschnitt Herstellung benutzt. Wenn der Patient noch offen auf dem OP Tisch liegt, können Absetzungsränder untersucht werden, um zu entscheiden ob der Tumor vollständig entfernt wurde oder ob nachgeschnitten werden muss.

    Ich kann mir ehrlich gesagt nicht vorstellen, dass das Ergebnis hübsch wird.

    Bilder füge ich ganz am ende ein! Und ehrlich gesagt... ich bin davon mehr als begeistert....


    Die Probe einfach so wie du zeigst in DMSO einfrieren dauert so lange, dass dir unweigerlich riesige Eiskristalle deine Strukturen zerstören. Ich betreibe einigen Aufwand, um das zu vermeiden. Selbst die Probe in flüssigen Stickstoff werfen (-200 °C) reicht nicht. Wird zwar augenscheinlich sofort hart, es hatte sich aber kurz eine isoliernde Gasphase um die (warme) Probe gebildet. Dehalb muss man vorher noch durch ein anderes Medium wie z.B. Isopentan. Die lästige Hampelei besteht darin, dass man das auch in einem Gefäß mit Stickstoff kühlt, es aber schnell zu kalt oder zu warm wird. Wenn festgefroren, dann Mist.

    also... ich kenne DMSO nur für die Haltbarmachung von DNA/RNA Proben zum lagern bei -80Grad. Wir verzichten auf diese schritte.

    Das Gewebe wird einfach nativ ohne Vorbehandlung ins kryogel gelegt und dann gefroren.

    Das Kryogel besteht aus Wasser, Polyvinyl alcohol,Polyethylene glycol,Kaliumformiat.

    Wird die Probe zu stark runtergekühlt, ist sie meistens auch kaum schmiedbar, da sie sehr spröde wird. (so unsere Erfahrung)



    Warum also nicht gleich fixieren und in Paraffin einbetten?


    Habe ich natürlich auch schon ausprobiert, aber die Strukturen verändern sich durch die Entwässerung sehr stark! Teilweise verschwimmen die Kontraste. Egal wie wir es gemacht haben.

    Momentan arbeite ich an einer PEG Methode ... angeschoben von Peter Reil.

    Außderm wird das material zwar schmiedbar... bei 1-5µm, je dicker umso weniger schneidbar, da das Material sehr spröde wird.. ab 10µm hast du nur noch Brösel auf dem OT.

    Wie dem auch sei, keine Anwendung für den Hobbymykologen.

    Da stimme ich dir absolut zu... jedoch steht die Technik zur Verfügung...

    Die REM wird auch gemacht, jedoch auch nichts für den Hobbymykologen :-D

    Du kannst deine Kryoschnitte übrigens halbwegs fixieren, wenn du sie nach dem Trocknen 10 min in Isopropanol inkubierst. Dann verlierst du die Schnitte nicht so leicht beim anschließenden Färben ;)

    Ja das habe ich probiert, aber auch hier gehen die Strukturen sofort kaputt. Paraphysen sind nur noch als kleiner strich zu erahnen, auch sind die Maße nicht mehr original, da hier häufig eine schrumpfung stattfindet.


    -> Wir verwenden für die Immunhisto spezial Objektträger, seit dem wir diese Benutzen schwimmt nichts ab, oder verkocht und wir machen täglich ne ganze menge davon. Diese Objektträger nutzen wir teilweise auch für Knochengewebe und Methylmethacrylat (Technovit9100)Schnitte. Diese Objektrräger sind speziell beschichtet und haben eine sehr hohe Adhäsionskraft.

    Ich kann mir ehrlich gesagt nicht vorstellen, dass das Ergebnis hübsch wird.


    und los gehts :kaffee:alle Bilder sind mit dieser Methode entstanden.

    hier sieht man etwas gebrösel, das liegt an der Schnittdicke und auffällig auch am alter des Fruchtkörpers, je jünger desto besser schneidbar.

    Das sind die Scans aus der Oben gemachten Methodenbilder

    35444576qo.jpg


    35444582jl.jpg


    35444591bj.jpg


    Hier die Jod Testung, hier ist das Kryogel nicht vollständig ausgewachsen worden und färbte sich bräunlich an

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    Und genau für solche Übersichtsbilder denke ich ist diese Methode interessant, sicherlich nicht für jeden... aber auch ausgetretene Pfade sollten mal verlassen werden;)


    35444605yf.jpg


    35444612mr.jpg


    35444621mt.jpg


    35444629lg.jpg


    35444636sm.jpg


    35444643pt.jpg


    Es gibt noch viel zu verbessern 8o


    Alex

  • Hallo Alex,

    danke dass Du uns das einmal erklärst. Ich fand schon das letztens von Dir gezeigte Mikrofoto, das auf diese Weise entstanden war, beeindruckend und Deine Fotos oben bestätigen die Effizienz dieser Methode. Du bekommst gestochen scharfe Bilder, weil das Präparat nicht mehrere überteinanderliegende Lagen Zellen umfasst. Schön anzusehen!

    Lieben Gruß


    Claudia


    ...leben und leben lassen... ;)


    Hier im Forum gibt es grundsätzlich keine Verzehrfreigaben.

  • Moin Alex,


    da muss ich doch mal zugeben, dass deine "schnelle Kryotechnik" für Pilzmaterial durchaus tauglich ist ==Gnolm8

    Wenn man so darüber nachdenkt, ja auch erklärbar: ein einheimischer Asco-Becher muss es gewohnt sein, nachts auch mal einfrieren zu können, ohne gleich Matsch zu sein. Gut möglich, dass das Zytoplasma auch Gefrierschutzmittel (Glykole) enthält. Ein Stück Milz so behandelt sieht ganz anders aus. Unsere Zellmembran hat aber auch keine Chitin-Verstärkung. Außerdem sind die Strukturen, auf die es ankommt, deutlich größer! Wie dick hast du jetzt eigentlich geschnitten? Der Schnitt oben in Nr. 9 ist ja schon ein ganz schöner Oschi. Macht ja auch Sinn. Leichter zu händeln und was will man mit lauter angeschnittenen Schläuchen und Sporen. So gesehen auch nicht verwunderlich, wenn man mit Paraffin Probleme bekommt. Pilzmaterial ist in seiner Festigkeit ganz anders als tierisches Gewebe. Die Methode ist bestimmt nicht einfach übertragbar. Da müsste man erst für gute Ergebnisse verschiedene Wachshärten, Schneidetemperaturen, Messerwinkel -und Härtegrade ausprobieren. Mal suchen, was es da an Protokollen gibt.

    Die Schrumpfungsproblematik nach Fixierung ist natürlich noch so ein Problem, das du hiermit umgehst. Vor allem, wenn man die Probe noch bestimmen will bzw. als Beleg angefertigt hat. Ist ja in der Histo sonst nicht so wichtig bzw. man hat ja seinen internen Maßstab über den Erythrozyten-Durchmesser. Oder zu jeder Pilzprobe in den Finger pieksen ==Gnolm4


    Klar, für die nötige Adhäsion brauchst du beschichtete OT. Wir silanisieren die sogar selbst, spart Geld. Ihr habt es aber nicht zufällig geschafft, entplastete Technovit9100-Schnitte von Knochenmark zu autoklavieren, ohne dass die Bälkchen abschwimmen? Dann komm ich sofort vorbei. Wir wussten uns nicht anders zu helfen, als die umständlicherweise mit einem Epoxidkleber festzukleben.


    Sag noch mal kurz, mit was du rot/blau gefärbt hast. Sieht aus wie Methylenblau-Fuchsin?


    Alles in allem noch mal Danke für die Anregung ==Gnolm8


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