2 tolle Cortinarien - Sequenzierung

Hallo Pilzfreunde,

in diesem kleinen Bericht möchte ich ein paar neue Erfahrungen zum Sequenzieren vorstellen.
Diesmal geht es z.B. um "Masking", "manuelles Basecalling" und Cortinarien.
Inzwischen habe ich einige Sachen vertieft und Dinge gelernt die den einen oder anderen Pilzfreund (eher den Praktiker als den Theoretiker) vielleicht nützlich sein können.
Diese Bericht baut auf diese 2 Berichte auf:

Tiefer Einblick in ein Stockschwämmchen - Pilzbestimmung u. Bestimmungshilfe - Pilzforum.eu
Psathyrella - lasset uns sequenzieren ;-) - Pilzbestimmung u. Bestimmungshilfe - Pilzforum.eu
Diese beiden solltet Ihr vorher mal gelesen haben wenn Euch das Thema interessiert.
Ich beschreibe alles wie immer an 2 echten Praxisbeispielen.

Praxisbeispiel 1:

Ihr erinnert Euch vielleicht an den tollen, seiner Zeit aber völlig unklaren Cortinarius-Fund vom 27.12.2015:

Fundnummer: 2015-12-27-0923

Makrodaten:
Fundort: ca. 550 müNN. ca. N50, O12, bei verschiedenen Laubbäumen
Fundzeit: 27.12.2015
Wuchsform: gesellig, teils büschelig
Hutform: konvex, teilweise mit leichtem Buckel
Huthaut: weiß geschuppt (befasert) auf orangem Grund
Hygrophanität: ja
Hutrand: weiß, jung: etwas befilzt, alt: nach oben gebogen
Lamellen: entfernt stehend, jung: orangecreme, alt: braunorange, mit Zwischenlamellen, mit Y-Gabelungen
Lamellenschneiden: etwas weißlich
Lamellen-Stielübergang: ausgebuchtet und leicht herablaufend
Stiel: weiß, minimal braun befasert im oberen Bereich, längsfaserig, wattig ausgestopft
Velum-Farbe: weiß
Stielbasis: sehr spitz
Fleisch: creme, etwas orange anlaufend im Längsschnitt, deutlich orange anlaufend im Stiel-Querschnitt und zwar in der Stielrinde mehr als im Zentrum
Größe: Hutdurchmesser ca. 3-5 cm, Stiellänge 4-7 cm, Stieldurchmesser ca. 10 mm
Sporenpulverfarbe: Pantone 160U = ████
Geruch: erdig, zerrieben pilzig nach Anis-Champignon
Geschmack: nicht probiert
Exsikkat-Farben: Huthaut: hellbraun, Lamellen: orangebraun, Stiel: beige, Fleisch: beige

Mikrodaten:
Sporen:
leicht gewarzt, braun, dickwandig, etwas dextrinoid (weinrot-braun) in Melzer–™s
(6.9) 8 - 9.1 (9.6) x (4.4) 5 - 5.9 (6.7) µm
Q = (1.3) 1.4 - 1.6 (1.8) ; N = 57
V = (70) 109 - 162 (215) µm ³
Me = 8.4 x 5.6 µm ; Qe = 1.5 ; Ve = 138 µm ³




Schlüsselt man mit FN kommt man auf den Birken-Gürtelfuß (Cortinarius bivelus) - der es mit viel Fantasie sein hätte können (ist es aber nicht).
Diesen äußerst merkwürdigen, interessanten Fund musste ich natürlich weiter untersuchen.
Er wanderte also in den Sequenzierautomaten. Das Ergebnis war jedoch sehr ernüchternd.

Die Rohdaten-Qualitätsbewertung:
Die Rohdaten sahen wirklich schlimm aus:

An den stark abfallenden Amplituden (hier in Farbe cyan eingezeichnet) erkennt man, dass das Signal schwach und verrauscht war.
Der Rauschabstand, also das "C über N" (bedeute Signal über Rauschen) ist nicht gut, vor allem an Anfang (in den Rohdaten das Ende) der Sequenz.
Ein gutes Signal (einer anderen Sequenz) schaut z.B. so aus:


Eine solch schlechte Sequenz wie bei diesem Fund kann verschiedene Ursachen haben.
Z.B. zu niedrige DNA-Template Konzentration, falscher Primer, unvollständige Protein-Entfernung, chemische Verschmutzung der Probe, etc.
Man kann nun
a) das Problem technisch lösen, indem man eine neue Probe mit höherem Aufwand neu sequenziert oder
b) eine Rückwärts-Sequenzierung durchführt, oder
c) versucht mit den brauchbaren Stücken der Sequenz trotzdem eine Bestimmung oder Bestätigung der Bestimmung durchzuführen.

In der Regel geht man den Weg c) --> b) --> a) - was ich hier nun tat.
Sehen wir uns nun die gefilterten und komprimierten Daten im vorderen (in den Rohdaten hinteren) Bereich an:

Wir erkennen, dass die Sequenz voller so genannter "Doublepeaks" ist - gelb markiert.
Confidence Scores:
Die Confidence-Scores, das sind Qualitäts-Werte (das sind die Balken oben an der gestrichelten cyan-farbenen Linie) sind schlecht.
Ist ein Balken unter der Cyan-Linie bedeutet das in der Software Finch TV zum Beispiel: schlecht, über der Cyan-Linie: gut.
Die DNA-Software berechnet die Confidence-Score: Q = -10 * log₁₀(Fehlerwahrscheinlichkeit)
Beispiele:
Bei einer Fehlerwahrscheinlichkeit von 1 zu 10 (=0,1) ist die Qualität Q = 10.
Bei einer Fehlerwahrscheinlichkeit von 1 zu 100 (=0,01) ist die Qualität Q = 20. --> das ist die z.B. Cyan-Linen-Grenze in der Software "Finch TV"
Bei einer Fehlerwahrscheinlichkeit von 1 zu 1000 (=0,001) ist die Qualität Q = 30.
Bei einer Fehlerwahrscheinlichkeit von 1 zu 10000 (=0,0001) ist die Qualität Q = 40.
Usw. Es wird hier klar dass es 100% Fehlerfreiheit zwar niemals geben kann, Aber bei einer guten Sequenz erreicht man Confidence-Scores von über 50. Das heißt die Fehlerwahrscheinlichkeit ist 1 zu 100000 - und damit ist ein Fehler sehr unwahrscheinlich.

Das Confidence Score Diagram:
Bei solch schlechten Rohdaten wie bei diesem Fund muss man sich zunächst ein CSD machen (CSD = Confidence Score Diagram)
Es stellt die mittlere Qualität über die Basen dar und sieht so aus:

Wir sehen dass die Qualität nur zwischen BP 20 und BP 500 OK ist, der Rest sollte nicht für die erste Grobanalyse herangezogen werden.
Wie wir hier weiter kommen sehen wir nun...

Zurück zu unserer Sequenz:
Der vordere und hintere Bereich der Sequenz ist also quasi unbrauchbar. Mit diesen Bereichen der Sequenz ist quasi nichts anzufangen.
Der mittlere Bereich der Sequenz zeigt jedoch einigermaßen gute Confidence-Scores.
Insgesamt betrachtet ist die Sequenz so dermaßen schlecht, dass eine BLAST-Abfrage ohne jede Handarbeit gar keinen Sinn macht.
Tut man das trotzdem, landet man bei Cortinarius und bei Hebeloma jedoch gibt es logischer weise keine gute Übereinstimmung zu irgend einer Art.
Man kann damit also NUR die Gattung Cortinarius oder Hebeloma bestätigen.

Aber: Da ich die makroskopischen und mikroskopischen Daten kenne und eine Vorab-Bestimmung durchgeführt habe, besteht nun die Möglichkeit, Sequenzen der vorbestimmten Art Birken-Gürtelfuß (Cortinarius bivelus) und nahe stehenden Verwandten Arten mit brauchbaren Teilstücken der Sequenz zu vergleichen. Ergibt sich hieraus eine Eindeutigkeit - dann ist die Art bestätig oder eben bestätigt dass es sie nicht sein kann.
In jedem Fall jedoch wird klar werden ob sich Schritt b) überhaupt rentiert, denn es ist ja möglich dass überhaupt keine Vergleichssequenz vorhanden ist.
Man sieht hier wieder einmal wie wichtig es ist eine makroskopische / mikroskopische Bestimmung vor der Sequenzierung zu machen.
Eine sehr gute Sequenz für den Vergleich ist KX355542 (Cortinarius bivelus) aus Polen.
Beim Vergleich stellt sich jedoch folgendes heraus (hie rein Ausschnitt):

Vergleicht man die abweichenden Basen, erkennt man, dass sichere Basen teilweise auch nicht übereinstimmen und in meiner Sequenz DNA-Ketten sind die bei Coritnarius bivelus nicht vorhanden sind.
Wir können also sicher davon ausgehen, dass es sich nicht um Cortinarius bivelus handelt.

Sequence-Masking hilft weiter:
Mit einer einfachen, recht schnellen Methode kann man noch etwas aus einer solch kaputten Sequenz machen.
Man kann die eindeutigen Basenketten - z.B. die mit über Confidence-Scores 20 quasi "filtern", und die nicht eindeutigen als nicht eindeutig - also mit "N" kennzeichnen.
Diesen Vorgang nennt man "Maskieren". Wie geht das?
Zunächst sollte jede Sequenzierautomaten-Software die Confidence Score mit ausgeben und im .abi-File abspeichern.
Dies kann man überprüfen im Informationsbereich des Files.
Die Confidence Score kann auch nachträglich berechnet werden. Es gibt alternative Routinen die ein "besseres" Ergebnis als Standard-Berechnungen bringen.
Z.B. gibt es eine alternative Berechnungsroutine in der DNA-Baser Software (keine Freeware).
Zunächst wandelt man das Chromatogramm in ein fastq-File um. Wichtig dabei ist, dass es in einem definierten Format abgespeichert wird, welches sie Maskierungs-Software versteht.
Ich verwende dazu das fastq-Sanger-Format.
So sieht das original Sanger-File für meinen Pilz aus:

[font="Courier New"]@mein_Fund[font="Courier New"]
ACCCTGGATTTGAGGTCACATTGATAAAGGATTGTCCAAGTAAATGGACTGTTAGAAGCTAAACTTGTGCTTTACCGTCAATAGCGTAAATAGTTATCACACCAA
TGAGCAGTAAACAAATTGTTTTGCTAATGTATTTTAGGAGAGCCGACCTCAAGAGAAAGAGTCCAGCAAAAACCCCCACATCCAACACTCGTCATGCAAAAAAGC
CGAAAAGGGTTGATATATTAATGACACTCAAACAGGCATGCTCCTCGGAATACCAAGGAGCGCAAGGGGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAAT
TCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCGAGAGCCAAAAGATCCGTTGCTGAAAGTTGTATAAGTTTATAGGCACAAAGGCCTGTTTATTAC
ATTCTATAAACATACATGGGGGTATATGAAAAACATAGACCTGGAAACGCAGGGAAAGACAAAAAATCATTCCTCAAACCTGAATCTGTAAGGAATTCAGAGAGA
TATCCGGGTCTACAAAAGGTTCACGGGGGGAAATATAAAGATGACAAGGGTGCACATGCTCCCTAAAAAACCAGAAGAAACTCACCAGGTTAATTTCAAAAATGA
TCCTTCCGCAGGTTCACCTACGAAAACCTTGTAACAACTTTAACTTCCTCAATTTGACCAGGA
+
%&&%/&&'>=(+587.-5*5F8D7NON0I87M7OOD7I7ODUN7DUDDNNNUNUUXUXXXXXXM5/51:UUNNNII57=D?ID7750:715/NUUNNUI55E??:
05577D::UU:UUUN505IGD?515E--5DDJJ666::5-5BD=77UNNUG))5-E5505OUUU?UIXXUUNXXNNIUNNUNII?NII????F005NXXXUUNIN
:DD::1NNLDD?DOOON=/5++-?C=D=IUUNUNM?=-05=DONNM5-?5?UUUUO655?DDIDDD651NNNDDNL//5?<5-5//7GB?=0:DNNNN==5NUIU
UUUD?D?DMI?UUUNNNUUUU:/:DUUUIUUNIINUIINND=505GGG?5++::NUNUNN://1LI6LDD:1:UUNUU:/:HHK?::DUOIUIO:15C:1:707N
UUDNUUUU505==J:00NNLDDDDUUIUXXUUUDDIOOOI::=6IF=D?F5F50D:1:UIXUUN5//:5((5/0:<:/:1005++007500C5((5055-5--00
:006-75-6--/;HD5-A5<65:-5553-+---7/:D://1007;:/50+-5:<:+-5//:8--555D0-???DIINOL5+-85++6GDJ::/F;0055-++--5
/7/5/:57::FF5--/5//:@5D=5/=:5055--770/D::0-/5/95,-.--+)-0A7-/-.

Das sieht verwirrend aus - ist aber ganz einfach: Grün - das ist nichts anderes als die Sequenz wie in einem .fasta-File.
Was dazu kommt sind die Confidence-Scores (blau) und zwar im ASCII-Format, sodass die Maskierungs-Software damit arbeiten kann.
Damit geht man also nun in die Maskierungs-Software, und sagt ihr: Ersetze alle Basen, die schlechter als 20 sind mit "N".
Ich verwende die Software "Fastq-Masker".
Heraus kommt:
[font="Courier New"]@mein_Fund-masked
NNNNNNNNTTNNNGGNNNNNTTGATAANGGATTGTCCAAGTAAATGGACTGTTAGAAGCTAAACNNNNGCTTTACCNTCAATAGCNNAANNNGTTATCANNCCAA
NNNGCAGTAAACAAANNNTTTTNNNANNNTATTTTAGGNNNGCCGACCTCANNNNANNNNGTCCAGCAAAAACCCCCACATCCAACACTCGTCNNNCAAAAAAGC
CGAAANGGGTTGATATATNNNNNACACTCAAACAGGCNNNCTCCTCNNANTACCAAGNNGCGCAAGGNNCGTTCAANNNTTNNNNNATTCANTGAATTCTNCAAT
TCACATTACTTATCGCATTTCGNTGCGTTCTTCATCGATGCGNNNGCCANNNGATCCGTTGNNNAAAGTTGNATAAGTTNATAGGCACAAAGGCCNNTTNATNAC
ATTCTATANNNATACNNGGGGGTATATGAAAAACATAGACCTGGAAACGCNGNNAANGACAAAANNNCNNNNNNCAANCNNNNNNNNGNNNGNNNNNNNNNNNNN
TNNCNGNNTNNNCAANNGNTTNANNNNNNNNNNTNTAANNNNNACANNNNNNCACNNNNNCCNNNNNANNCCAGAAGAANNNCNNNAGGTTANTTNNNNNNNNNN
NCNNNCNGCAGGNNNNNNNACNAANNCCNNNNNNCANNTTTNNNNNCNNNNNNNNNNCCNNNN

Ja, viel bleibt nicht übrig - das ist klar.
Da die Roh-Sequenz als reversed complement vorlag, muss ich daraus das reversed complement bilden:[font="Courier New"]
@mein_Fund-masked_rev_komp
GAGGAGNNNGCCTGTTTGAGTGTNNNNNATATATCAACCCNTTTCGGCTTTTTTGNNNGACGAGTGTTGGATGTGGGGGTTTTTGCTGGACNNNNTNNNNTGAGG
TCGGCNNNCCTAAAATANNNTNNNAAAANNNTTTGTTTACTGCNNNTTGGNNTGATAACNNNTTNNGCTATTGANGGTAAAGCNNNNGTTTAGCTTCTAACAGTC
CATTTACTTGGACAATCCNTTATCAANNNNNCCNNNAANNNNNNNNCNNNCNNNNNNNNGNTTGNNNNNNGNNNTTTTGTCNTTNNCNGCGTTTCCAGGTCTATG
TTTTTCATATACCCCCNNGTATNNNTATAGAATGTNATNAANNGGCCTTTGTGCCTATNAACTTATNCAACTTTNNNCAACGGATCNNNTGGCNNNCGCATCGAT
GAAGAACGCANCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGNAGAATTCANTGAATNNNNNAANNNTTGAACGNNCCTTGCGCNNCTTGGTANTNNNNNNGGNNNNNNN
NNNGNNNNNAAANNTGNNNNNNGGNNTTNGTNNNNNNNCCTGCNGNNNGNNNNNNNNNNNAANTAACCTNNNGNNNTTCTTCTGGNNTNNNNNGGNNNNNGTGNN
NNNNTGTNNNNNTTANANNNNNNNNNNTNAANCNNTTGNNNANNCNGNNANNNNNNNNNNNNN

Man sieht hier dass es ein Irrgang wäre, wenn man nur den Mittelbereich der Sequenz verwenden würde indem man vorne und hinten die schlechten Teile abschneidet wie es oft getan wird.
Das Masking ist hier eine Pflicht!

Weiter gehts mit BLAST und einer Lineage:
Mit dieser Maskensequenz gehe ich nun wieder in BLAST, Taxon-ID: fungi, und zwar alles was "uncultured" ist gleich ausblenden, denn bei Cortinarius sind sehr viele uncultured dabei, die nur stören. Also weg damit. Man findet damit logischer Weise eine ganze Palette an Arten, die theoretisch in Frage kommen. Und zwar - ganz überraschend - mehr Hebeloma als Cortinarius. Genauer gesagt nur eine einziger Cortinarius der zugleich noch eine wahrscheinlich falsch bestimmte Hebeloma ist! Also NUR Hebelomas...
Hier das Ergebnis als so genannte Lineage:

Überrascht?
Ich auch!
Aber das heißt an dieser Stelle noch gar nichts. Bestimmte Ketten KÖNNEN Gattungsübergreifend gleich sein. Bei Hebeloma und Cortinarius ist das so.

Schränkt man die suche auf Gattung Cortinarius ein passiert folgendes:


Gleich als erster in der Liste taucht (hier zufällig) eine Telamonie auf, die in FN nicht gelistet ist.
Der Schuppigzerrissene Gürtelfuß (Cortinarius incisus).
Und dieser passt laut Beschreibung (nach der ich in der Literatur lange suchen musste) erstaunlich gut auf unseren Fund.
Sollte das die Lösung sein?

Manuelles Base-Calling über Einzelsequenzen:
Eine Möglichkeit um weiter zu kommen ist das manuelles Base-Calling über Einzelsequenzen.
Es gibt noch das Verfahren über das manuelle Base-Calling über eine Sequenzsammlung und Divergence-Map (was das ist erfahrt Ihr im nächsten Praxisbeispiel).
Ich verwendete an dieser Stelle aber Einzelsequenzen, weil anhand der morpholigischen, mikroskopischen und DNA-Bruchstücke schon einigermaßen sicher war, dass es ein bestimmter Pilz, nämlich Cortinarius incisus oder eine nahe stehende Art ist UND weil ich ein Masking vorher machen musste.
Ich suchte mir KU973875 als erste Sequenz aus für die manuelle Korrektur der schlechten Basenamplituden, alignete diese - und korrigierte die offensichtlich falschen Basen von hand:

Dies wiederholte ich mit anderen Sequenzen die ich dieser Session hinzufügte so lange, bis keine Unklarheit mehr vorhanden war.
Dass hier nach jeden Schritt ein Alignment gemacht werden muss versteht sich von selbst.
Am Ende hatte ich folgende Palette von Sequenzen, die für einen finalen Basenvergleich für qusi-Eindeutigkeit sorgte:

[font="Courier New"]KU973875 Cortinarius incisus Tunesien
AY669656 Cortinarius incisus Deutschland
GQ159899 Cortinarius pseudoduracinus Kolumbien
KC581333 Cortinarius acutus Kanada
HQ604677 Cortinarius junghuhnii Kanada
HQ604674 Cortinarius acutus Kanada
HQ604675 Cortinarius junghuhnii Kanada
GQ159781 Cortinarius acutus Kanada
FJ157001 Cortinarius acutovelatus Kanada
KC842420 Cortinarius acutus Norwegen
FJ039609 Cortinarius acutovelatus Kolumbien
AY083175 Cortinarius acutovelatus Indien
FJ717495 Cortinarius acutus Kolumbien
AY669655 Cortinarius acutovelatus Deutschland
FJ039695 Cortinarius laetus Kolumbien
FJ039608 Cortinarius ceraceus Kolumbien
FJ039692 Cortinarius acutus Kolumbien
FJ039693 Cortinarius ceraceus Kolumbien
HQ604679 Cortinarius acutus Kanada
HQ604678 Cortinarius junghuhnii Kanada
FJ039606 Cortinarius ceraceus Kolumbien
FJ157002 Cortinarius acutus Kanada
GQ159809 Cortinarius rigens Kanada
AF325578 Cortinarius acutus USA

Outgroup (für das gleich folgende Phylogramm):[font="Courier New"]
KJ635244 Outgroup

Das Ergebnis muss eine saubere Übereinstimmung der vorher "schlechten" Basen sein. Selbstverständlich darf man keine guten Basen dabei umbiegen.
Nur die schlechten werden korrigiert. Und so sollte das Ergebnis dann aussehen (erste Zeile ist unser Fund):


Phylogenetische Analyse
Nach einem solchen Abgleich ist es normalerweise nicht mehr nötig weiter im Blast-Nirvana zu fischen.
Es kann gleich eine phylogenetische Analyse mit bekannten Arten durchgeführt werden.
Die roten Werte sind die so genannten "Bootstrap-Werte" - über die werde ich mal genauer berichten:

Ganz klar - unser Fund ist zumindest mit den bekannten Sequenzen Cortinarius incisus.
Nebenbei erkannt: Dass Cortinarius acutus und Cortinarius junghuhnii offensichtlich Phantome sind sollte nun klar sein. Hier verstecken sich mehrere Arten die noch nicht sauber getrennt sind oder teilweise zu einer Art zusammengefasst werden sollten.

Ich musste einige Literatur wälzen um den Pilz endgültig zu bestätigen.
Hier die Beschreibung nach Adalbert Ricken, in "Die Blätterpilze (Agaricaceae) (1915)":




Hier also nun viel Spaß mit diesem schönen Pilz - der Schuppigzerrissene Gürtelfuß (Cortinarius incisus):
"Schuppig" und "zerrissen" - in der Tat...
Hier die ganz jungen Exemplare:

Etwas älter:




Alt - schön aufgerissen:




Praxisbeispiel 2:
Ihr erinnert Euch vielleicht ebenso an diesen grandiosen Fund.

Fundnummer: 2015-11-10-1453

Fundort: ca. 550 müNN. ca. N50, O12, auf Rasen, bei Weide (Salix spec.)
Fundzeit: 10.11.2015
Wuchsform: büschelig
Hutform: konvex bis abgeflacht, Mitte kaum vertieft, wellig uneben
Huthaut: hellbraun mit Lilaton, seidig, radialfaserig
Hygrophanität: nein
Hutrand: saumartig, mit wenig bräunlichem Behang
Lamellen: braun, mit Zwischenlamellen, weit entfernt stehend, mit Y-Gabeln
Lamellenschneiden: ohne Besonderheiten
Lamellen - Stielübergang: gerade angewachsen
Stiel: weiß, längsfaserig, oben braun befasert, mit weißer Ringzone, voll
Velum-Farbe: weiß
Haarschleier-Farbe: braun
Stielbasis: keulig verdickt
Fleisch: creme mit Violettton
Größe: Hutdurchmesser ca. 3-8 cm, Stiellänge ca. 6-9 cm, Stieldurchmesser ca. 20 mm
Sporenpulverfarbe: nicht getestet
Geruch: gut pilzig
Geschmack: nicht probiert
Exsikkat-Farben: Lamellen dunkelbraun, Huthaut graubraun, Stiel außen: beige, Stielfleisch hellbraun. Die Lilatöne sind komplett verschwunden.

Ich nahm keinen Geschmack auf, ebenso konnte ich die Sporendaten nicht aufnehmen (da ich keinen Sporenabwurf angefertigt hatte), auch die makrochemischen Reaktionen nahm ich nicht auf.
Schlüsselt man nach FN wird es schwer. Es ergeben sich verschiedene Wege. Zum Beispiel kommt man beim Weißvioletten Dickfuß (Cortinarius alboviolaceus) heraus, für diesen passt die Weide nicht.
Der richtige Weg, den ich zwar unter anderen im Auge hatte, aber wirklich unsicher war ist dieser:
Seite 762 > HS1 > Reifpilz ist es nicht > HS2 > HS4 > HS5 > HS6 > subgen. Telamonia p. 826 > ST1 > ST21 > ST46 > ST47 > ST51 > ST52 > ST53 > Key L > da Sackgasse: Key F > F1 > F2 > F4 > Cortinarius saturninus

Doch auch hier bestand das Problem, dass es weitere Arten gibt die in FN gar nicht gelistet sind.
Ich musste also eine Sequenzierung und Sequenzanalyse durchführen um dem wunderschönen Pilz auf die Schliche zu kommen.
Die genomische DNA wurde aus getrockneten Fruchtkörpern extrahiert. Die Amplifikation der ITS-Region wurde mit dem ITS4 Primer durchgeführt. Die Nukleotid-Sequenzen für die Berechnung des Phylogramms wurden aus NCBI und Unite entnommen.
Das Ergebnis: Glück gehabt! Es gibt eine deutliche Übereinstimmung mit einem potentiellen Pilz der schon mit FN geschlüsselt werden konnte - Cortinarius saturninus!
Für die Analyse habe mal eine etwas weitere Arten-Bandbreite gewählt, da sieht man schön, wo der Pilz steht.
Das folgende ML-Phylogramm zeigt die Positionierung des Pilzes (Die roten Werte sind die ML Bootstrap-Werte).


Nun schaut Euch diesen extrem schönen Pilz genau an.
Ich präsentiere: Den Blaufleischigen Wasserkopf (Cortinarius saturninus) - der bei mir endgültig das Cortinarius-Fieber auslöste:

Ich hoffe Ihr hattet Spaß an meinen kleinen Bericht und Freue mich über Eure Kommentare.
Beste Grüße
Dieter

Vielen Dank erst mal an alle,
Danke auch für die Hinweise zu dem - je sagen wir mal - incisus-Sequenz-ähnlichen.
Das werde ich mir nochmal genauer ansehen - wird aber etwas dauern.
Von dem Pilz habe ich Euch noch Bilder vorenthalten - er ist sehr variabel.
Ist auch völlig glatt ohne Schuppen zu finden gewesen (wenn nass und älter) - und passt (mit den starken schuppen wenn jung) eben auf die originalbeschreibung von 1801. @Pablo, nein die Farben waren schon so wie ich schrieb - und du wirst an den anderen Kollektionen sehen wie gut er auf die Beschreibeung passt - dazu aber später.
Duracini schaue ich mir nochmal an, obwohl schon getan, schloss ich aber anhand der sicheren Basen schon aus.
Vielleicht weiß ja jemand noch mehr über dieses Mysterium.
Solange setze ich den Pilz nochmal zurück auf "Cortinarius spec.".
Wenn Zeit ist nache ich nochmal eine Rückwärts-Sequenzierung - denn den dürfen wir ja so nicht stehen lassen
Beste Grüße
Dieter

Hallo Andreas,
danke für die Fragen. In Kürze...

Zitat von mollisia

Allerdings habe ich gelernt, dass man dabei seeehr zurückhaltend sein soll, und im Zweifelsfall lieber lassen soll oder mal auf Y, M, K etc. korrigiert, also auf die Doppel- oder Triple-Codes.

Ja, das ist richtig, wenn man mit der Sequenz suchen gehen will.
Unnötig wenn es in dem Such-pool keine Sequenz gibt bei dem die nicht passende Base vorkommt.

Zitat von mollisia

Ferner habe ich beigebracht bekommen, dass man die Bereinigung vorher macht, bevor man aligniert. Gerade eben um sich nicht beeinflussen zu lassen.

Ja, das passt. Siehe Beispiel 1. Bei Beispiel 2 kommt aber das gleiche raus (natürlich schnell mal probiert). Genau das wollte ich damit sagen.
Du hast wahrscheinlcih das Test-Alignement verwechselt mit dem ich prüfte ob es bivelus überhaupt sein kann.
Das kann man auch ohne jede Korrektur vorher mal machen.

Zitat von mollisia

Bei deinem oben gezeigten Beispiel 2, beim Chromatogramm, zeigst Du dass Du manuel die Base von A (grüne Bande) auf G (schwarze Bande) änderst. Warum tust Du das - die grüne Bande ist die stärkere,

Ganz kurz und schnell vorab: die Höhe des Ausschlages zeigt an dieser stelle nicht an, ob es ein A oder ein G ist.
Man betrachtet 3 Dinge:
a) welche Ausschläge gibt es (nicht wie hoch sind sie)
b) wie hoch ist die Confidence score an der stelle?
c) Welche Basen sind im Vergleichspool an dieser Stelle vorhanden.
Dann ändert man auch nicht einfach so auf G, sondern entscheidet ob man auf G ändern muss, auf A lassen muss, oder aber auf R setzen muss.

Zitat von mollisia

und wenn du schon änderst, dann doch am ehesten in einen Doppelpeak R (R bedeutet A oder G).

Richtig, wenn man mit der Sequenz suchen gehen will ODER wenn im suchpool welche mit A, G oder R vorkommen.
Unnötig wenn es in dem Such-pool keine Sequenz gibt bei dem die nicht passende Base vorkommt UND wenn kein weiterer Ausschlag vorhanden ist.
Zeige ich mal in einem weiteren Beispiel wenn ich Zeit hab.

Zitat von mollisia

Und wenn Du diesen Peak an der Stelle von A auf G abänderst, warum änderst Du dann nicht den Peak davor von A auf C?

Weil aus eben der genannten Prüfung wie oben beschrieben folgt dass nur A stimmen kann.
Wenn aus der Prüfung folgt, dass nur C stimmen kann, hätte ich sie auf C gelassen.
Wenn - was auch vorkommt beide möglich sein können dann ändere ich auf M.

Zitat von mollisia

Und noch mal ein paar Peaks davor ist dieselbe Doppelspitze wie deine korrigierte - warum korrigierst Du da nicht?

Weil aus eben der genannten Prüfung wie oben beschrieben folgt dass nue A stimmen kann.

Ich sehe dass die Thematik gut ankommt.
Ich werde wenn Zeit ist mal auch die von Andreas beschriebene Methode hier vorstellen falls ein Pilzchen dabei ist wo diese nötig ist.

Zitat von mollisia

Ich glaube dass diese starke Korrektur mit bereits vorgefasster Meinung nicht statthaft ist, gefühlsmäßig. Aber wie gesagt kenne ich mich nicht wirklich damit aus.

Ja, das verstehe ich. Würde mir auch so erscheinen.
Es ist anders:
Die komplette Divergence Map enthält einige hundert oder wenn's sein muss auch tausend Einträge - welche dann numerisch ausgewertet werden (da optisch gar nicht mehr erfassbar) - das ist mit einer schnellen (ungenauen) manuellen Korrektur wie Sie Dir bekannt ist (also auf dual, triple oder quad ändern) nicht vergleichbar. Was nicht heißt dass diese ungenaue Korrektur fals ist - sie ist eben nur ungenauer.

Zitat von mollisia

Die gekniete und spitz auslaufende Stielbasis, der steife weiße Stiel ohne sichtbare Velumreste - das sind ganz eindeutige Kennzeichen der Sektion Duracini nach traditioneller Umgrenzung (Moser z. B.). In Funga Nordica wurden einige Arten der bisherigen Duracini zu den Acetosi gestellt, und in der Tat sind da die Übergänge zumindest morphologisch nicht immer klar. Aber dein Pilz ist auf jeden Fall unter denen zu finden, die in Moser in der Sektion Duracini aufgeführt sind oder ein naher Verwandter dieser Arten.

Danke für den Hinweis, das schaue ich mir noch an (dauert)
Beste Grüße
Dieter

Hallo,
Follow up hier:
https://www.pilzforum.eu/board…se-zu-cortinarius-incisus
Beste Grüße
Dieter