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letzter Beitrag von Wutzi am

Spore im Konfokalmikroskop

  • Hallo Freunde der Mikroskopie,


    ich habe endlich etwas ausprobiert, was ich schon immer einmal machen wollte: Pilze gucken mit dem Konfokalmikroskop! Nehmt euch nen Keks :kaffee:

    Vorab: Ich wollte nur ausprobieren, ob es klappt; zur Bestimmung oder sonstigem Erkenntnisgewinn taugt es eher nicht. Es sei denn, man gibt sich Mühe und fertigt je nach Fragestellung ordentliche Präparate an. Wird ja sicher in der Mykologie auch gemacht.


    Außerdem möchte ich einmal die Konfokalmikroskopie vorstellen, kennt ja nicht jeder.

    Hier ein paar Basics, dazu Bild 1: als Lichtquelle dienen mehrere LASER (der Kasten rechts unterm Tisch, hier vier Farben der Wellenlängen 405, 488, 561 und 640 nm). Die Probe wird allerdings nicht -wie in der Lichtmikroskopie- durchleuchtet und als Bild angeschaut. Nein, es entsteht zu keiner Zeit ein "Bild"! Der Laser wird scharf auf einen Punkt fokussiert. Der Clou ist, dass dieser Punkt nur dann detektiert wird, wenn er das Laserlicht in genau dieser Wellenlänge absorbiert und daraufhin (in einer größeren, energieärmeren Wellenlänge) wieder emittiert. Dazu gibt es eine ganze Palette von Fluoreszenzfarbstoffen, die man in der Immunhistologie analog zur Durchlichtmikroskopie an seinen Gewebeproben nutzen kann. So, aber von einem Punkt hat man ja nix. Die Laser rastern nun nacheinander punktförmig eine Ebene ab - und bei Bedarf die nächste Ebene, und so weiter. Erst der Computer konstruiert das "Bild". Einige Vorteile: man erhält eine sehr scharfe Schnittebene. Alles, was "out of focus" ist, ist rabenschwarz! Streulicht wird außerdem durch eine Pinhole-Blende minimiert. Man kann in sehr viel dickere Proben eindringen und Strukturen in 3D darstellen.

    War das einigermaßen verständlich? Soweit zum Prinzip, weiterführend Wiki oder nachfragen, will ja nicht den Rahmen sprengen :sleeping:


    Bild 1 (Nikon-LSM): rechts unten der Laser, rechts auf dem Tisch Computer und Detektor, vorne rechts Fluoreszenzlampe zur normalen Fluoreszenzmikroskopie, um sich per Okular in der Probe zu orientieren. Die habe ich etwas abseits gestellt, weil der Lüfter mir Artefakte ins Bild vibriert hat (zusätzlich waren aber auch die Luftpolster-Füßchen am Mikro-Tisch platt, nun wieder aufgepumt). Alles mit Lichtleitern verkabelt.


    Bild 2: Ist ein inverses Mikroskop, damit die Freaks aus der Zellkultur ihre Platten draufstellen können. Das 100x-Öl-Objektiv ist mit einer num. Apertur von 1,45 nahe am physikalisch möglichen.


    So. Und ich wollte jetzt wissen, was man von einer Pilzprobe sieht! Täublinge sollen ja fluoreszieren können, wäre also eine gute Wahl. Ob das auch auf die Sporen zutrifft, weiß ich nicht. Aber egal, wenn man mit dem Laser nur stark genug brezelt, fluoresziert alles. Besonders mit dem grünen Laser (488 nm), wo die Autofluoreszenz bei Gewebeproben auch immer ein Problem ist. Kann man mit den roten Lasern umgehen, allerdings büßt man bei größeren Wellenlängen an Auflösungsvermögen und Intensität ein. Wie immer Pest oder Cholera...


    Bild 3: Ein Stinktäubling. Vielleicht R. subfoetens, ist aber auch nicht so wichtig. Wollte irgendetwas mit hübschem Ornament.


    Was hab ich gemacht? Nicht viel Aufwand, ein paar Sporen über Nacht auf einen Objektträger rieseln lassen. Eingedeckt mit einem Tropfen Medium für Fluoreszenzproben, worin DAPI enthalten ist. DAPI interkaliert mit DNA und ist ein Fluoreszenzfarbstoff, der mit UV-Licht (Laser 405 nm) angeregt wird und blau emittiert. Standard, um Zellkerne darzustellen.


    Bild 4: Zunächst muss man den Strahlengang einstellen. Die gewünschten Laser anklicken (hier drei von vieren). Dazu die passenden Filter, damit man möglichst spezifisch die Emissionsspektren auf die Detektoren/Kanäle (Töpfchen Ch 1-3) verteilt. Gibt Listen, wo man seinen Farbstoff auswählen kann, dann wird einem das Spektrum angezeigt. die Filter sind eigentlich halbdurchlässige Spiegelsysteme, das passiert in den Kästen links neben dem Mikroskop (Bild 1). Interessant ist noch der "Transmitted Detector" (TD). In Bild 1 ganz oben drauf, der misst einfach, was vom 488-Laser gerade durch die Probe geht. Simulation der normalen Durchlichtmikroskopie, zur Orientierung in der Probe bisweilen brauchbar.



    Bild 5: Dann mal rein in die Einstellungen! Hier die wichtigsten, bischen blöd übereinandergeschoben. Zu kleiner Monitor. Im Aquisition Panel die drei Lasereinstellungen. Die Intensität plus einer Art Verstärkung (HV). Ihr seht, dass ich ordentlich hochgedreht habe: Laser auf 10.0 bei HV 50 ist brutal. Normalerweise nutze ich den Ch2 (grün) bei Laser 0.5 und HV 3! Die optimale Belichtung findet man mithilfe des Histogramms (unten etwas verdeckt); keinesfalls sollte z.B. das Signal rechts anschlagen (überbelichtet). Dazu kann man bei leuchtschwachen Proben die oversampling-Rate erhöhen, also jeden Punkt mehrmals messen (hier doppelt). Umso länger dreht man dann aber Däumchen. Auch habe ich nur eine Bildausgabegröße von 1024 px eingestellt, höher bedeutet wesentlich mehr Wartezeit. Mithilfe dieses Kubus rechts kann man nun seinen Z-Stack definieren. Also nicht nur eine Ebene in XY scannen, sondern deren viele in Z. Ich fand eine Höhe von 12 µm gut, um sicher ganze Sporen zu erfassen. Die angezeigten 0.061 µm stehen für das maximal physikalisch mögliche, das mit dem gewählten Objektiv auflösungstechnisch Sinn macht. Ich hab mich für 150 nm-Abstände entschieden (also 80 Bilder auf 12 µm). Das macht eine gerade noch mit meiner Ungeduld zu vereinbarende Messzeit von 8 min pro Aufnahme (bei 680 MB). Würde man alles hochdrehen, misst man Stunden und produziert Dateien, deren Größe nicht mehr tragbar ist.


    Das Ergebnis ist eine dicke Datei der Endung -.nd2. Ausgewertet wird natürlich (!) mit der freien Software ImageJ, die ALLES und noch mehr kann, was die Markensoftware der Mikroskophersteller in nicht nachvollziehbaren Operationen auch macht.

    Man erhält einen sogenannten Hyperstack, also eine Kombination aus den vier Kanälen (Ch1-3, TD) und den 80 slices des Z-Stacks. Kann ich hier schlecht zeigen; wenn gewünscht, versuche ich's mit Screenshots.


    Bild 6: Drei Sporen im Grünkanal, als Z-Projektion. Und zwar nur die Bilder 40-80, also nur eine Halbschale der Sporen. Man will ja nicht noch die Rückseite übereinanderprojizieren (macht man beim focus stacking ja auch nicht).


    Bild 7: So hat der TD die Sporen gesehen.


    Bild 8: Zum Vergleich eine einzelne Ebene (nicht projiziert), im TD.


    Bild 9: Verdammt. Hier sollte ein animiertes GIF rein, ein Durchflug duch die Ebenen im Blaukanal. Datei zu groß (59,8 MB). Mal sehen, ob ich es nachliefern kann.


    Bild 10: Ah, das 3D-GIF vom Grünkanal scheint zu klappen! Seitlich sieht man, dass ich mit den 150 nm Ebenenabstand an Auflösung gespart habe.



    Bild 11: Schade, dass das GIF-Bild 9 nicht hochzuladen ist. Dafür hier ein Einzel-Slice des Stacks Ch1. Durch die DAPI-Färbung gibt es einen Unterschied zum Rot- und Grünkanal: Man sieht bei jeder Spore eine DNA-Akkumulation an einer Stelle unter der Hülle. Darum gruppiert sind einige DNA-Knubbel als Punkte. Hat jede Spore. Kann das jemand erklären?


    Soweit meine Spielerei, die ich mir diese Woche nebenher gegönnt habe. Ich hoffe, ihr habt auch ein wenig Spaß daran :)

  • Hallo Drosophila, interessant, obwohl ich nicht alles verstanden habe. Auf alle Fälle sehenswerte Ergebnisse. Es ist schon verrückt, was so alles technisch geht.

    Lieben Gruß


    Claudia


    ...leben und leben lassen... ;)


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