Liebe Pilzfreunde,
ich möchte Euch heute die siderophile Granulation näher bringen. Mit dieser Färbemethode werden - falls vorhanden - siderophile Granula in den Basidien angefärbt. Unter dem Mikroskop kann man das Ergebnis begutachten.
Siderophile Granula findet man in Basidien in Fruchtkörpern der Gattungen Conocybe, Lyophyllum, Thephrocybe (heute zu Lyophyllum gestellt), Hypsizygus und Nyctalis. Bei den Gattungen Conocybe und Hypsizygus fällt die Färbung schwächer aus. Im Laufe der Zeit hat man herausgefunden, dass auch Pilzarten aus den Gattungen Agrocybe, Entoloma und Rhodocybe die Siderophilie aufweisen können. Der Nachweis der siderophilen Granula ist trotzdem ein gutes mikroskopisches Bestimmungsmerkmal für die Zugehörigkeit von Pilzen zu den oben aufgeführten Gattungen.
Reagenzien:
Eisenbeize (Vorsicht: diese Lösung ist giftig)
5 ml 10% FeCl3 in 50% Essigsäure
5 ml 10% Cu-Acetat in 50% Essigsäure
5 ml Pikrinsäure, gesättigte wässrige Lösung
5 ml Formaldehyd konz.
5 ml 1% Pb-Acetat in 50% Essigsäure
Die erste Acetatlösung tropfenweise zugeben, um Niederschlagsbildung zu vermeiden!
Karminessigsäure
In einer gut verschlossenen Flasche 3g Karmin in 100 ml 50% Essigsäure lösen, für 2 Tage bei 90 bis 95 °C inkubieren, gelegentlich Umrühren. Nach dem Abkühlen filtrieren. Überschüssiges Karmin kann wiederverwendet werden.
Hoyer ´s Medium
25 ml aqua dest.
100 g Krist. Chloralhydrat
15 g Gummi arabicum (Akaziengummi)
8 ml (=10 g) Glycerol konz.
Gummi arabicum in Wasser bei 50 bis 60 °C in einer gut verschlossenen Flasche auflösen (dauert ca. 1 Tag). Dann Chloralhydrat hinzugeben und gelegentlich umrühren. Anschließend das Glycerol einrühren.
Präparation und Färbung:
1. Pilzmaterial aus den Lamellen (ein kleines Stück mit einer Pinzette entnehmen) in einen kleinen Behälter mit einigen Tropfen Eisenbeize geben. 5 bis 10 min inkubieren. Man kann gleich mehrere Stückchen von Lamellen des zu untersuchenden Pilzes nehmen, falls eines verloren geht.
2. Die Probe direkt in ein mit Karminessigsäure gefülltes Eppendorfröhrchen geben. Die Probe soll vorher nicht gespült werden, da ein bisschen Beize in der Färbelösung vorhanden sein muss. Aufgrund der Anwesenheit des Beizmittels färbt sich die Färbelösung schwarz.
3. Im Wasserbad erhitzen: Das Eppendorfröhrchen gut verschließen und in ein Reagenzglas mit Wasser über dem Bunsenbrenner für 2 min erhitzen. Das Reagenzglas mit einer Holzwäscheklammer festhalten, das Reagenzglas beim Kochen etwas schütteln und die Reagenzglasöffnung von Personen weghalten, da das Wasser überkochen kann!
4. Nach dem Kochen kaltes Wasser ins Reagenzglas geben, Eppendorfgefäß herausholen, den Inhalt auf ein Papiertuch ausgießen.
5. Das Pilzmaterial (sieht jetzt schwarz aus) mit einer Präpariernadel aufnehmen und in einen Tropfen Hoyer ´s Medium aufnehmen. Das Pilzmaterial entfärbt sich etwas, also das Material gut durchziehen.
6. das Pilzmaterial auf einen Objektträger in einen neuen Tropfen Hoyer ´s Medium geben, Deckgläschen drauf, etwas quetschen, fertig.
Diese Präparation trocknet und bleibt dauerhaft, die Färbung wird nicht verblassen.
Ergebnis:
1. Positive siderophile Granulation (Gattung Lyophyllum). Man erkennt eindeutig die siderophilen Granula in den Basidien.
2. Negative siderophile Granulation (Gattung Russula). Alle Zellen sind irgendwie gleich gefärbt, keine siderophilen Granula erkennbar.
Quellen:
Der Tintling 1, 2003, 12. Folge, Teil 1 von H. D. Zehfuß
H. Clemencon: Methods for Working with macrofungi. Laboratory Cultivation and Preparation of Larger Fungi for Light Microscopy. IHW-VErlag 2009.
Gutes Gelingen beim Nachmachen. Es empfiehlt sich, das erste Mal diese Methode mit jemanden zu machen, der da schon bisschen Erfahrung hat!
Liebe Grüße
Kerstin
