Flechtenmikroskopie

Es gibt 18 Antworten in diesem Thema, welches 917 mal aufgerufen wurde. Der letzte Beitrag () ist von PBR.

  • Hallo zusammen,


    gestern Abend habe ich mich das 1. Mal an Handschnitte aus PEG imprägnierten Flechten gewagt.


    Über einen Tag in 20%iger PEG1500 Lösung auf einem Objektträger getrocknet und dann von Hand geschnitten.

    Mit ein bisschen Ruhe hat es passabel geklappt, aber da ist noch raum nach oben.


    Eine konkrete Frage hätte ich. Hat hier jemand Erfahrung mit Färben mit LCB (Bild 5+6 sind mit LCB+Säurefuchsin eingedeckt). Ich habe das so verstanden, dass LCB als Einschlussmedium verwendet wird und dann durch unterschiedliche Diffusionszeiten eine differentielle Färbung ergibt. Stimmt das? Wie geht man üblicherweise vor? Wie lange wartet man üblicherweise?


    Viele Grüße

    Peter



    Bild 1 X. parietina Apothecium


    Bild 2. X. parietina Ap. Detail.


    Bild 3. X. parietina Hymenium und Sporen


    Bild 4. X. parietina Thallus.


    Bild 5 Apothecium unbest. LCB


    Bild 6 Hymenium unbst. LCB

  • Hallo Peter, ich kann dir zwar in der konkreten Fragestellung nicht weiterhelfen, finde es aber Klasse, dass du PEG probierst. Das wollte ich auch schon lange habe es aber bisher nicht versucht, da ich vermutete, dass das nur in Kombination mit einem Mikrotom richtig gut wird. Deine Schnitte finde ich aber für einen ersten Versuch wirklich stark. Bisher habe ich es mal mit Parrafin versucht, um einen „Griff“ für sehr kleine Objekte zu haben. Das ging einigermaßen war mir aber bei Raumtemperatur zu weich.

    Danke dass du deine Erfahrungen mit uns teilst!

    VG Ingo


    PS: ein heisses Glas hast du da am Start..

  • Hallo Ingo.

    PEG hatte ich zuerst im Kontext von Handschnitten gesehen (z.B: https://www.lichenes.de/technische-informationen/) . Die Proben waren nachdem das PEG eingetrocknet war auch regelrecht am OT festgeklebt. Das war gut und hilfreich.


    Mikrotomschnitte möchte ich auch noch machen, aber ich scheue mich noch. PEG ist recht hygroskopisch, die Blöcke halten im Gegensatz zu Paraffin wohl nicht lange und müssen zügig verarbeitet werden. Im Moment habe ich keinen festen Arbeitsplatz und muss immer auf und abbauen.


    Wenn es interessant ist und hier ins Forum passt erweitere ich gerne den Thread mit dem was ich so auf dem Weg lerne. (oder soll es eher in den Mikroteil des Forums?)


    Peter


    PS: über Glas kann ich mich nicht beschweren, ich nähere mich dem Thema von der Mikro Seite her. Die Bilder sind auf einem BX40 mit umgebauter Beleuchtung gemacht. DIC mit UPlanFl 10x, 20x, und UApo340 40x/W und UPlanSApo60x/W. Dafür sind die Fotos nur mit Mobiltelefon durchs Okular weil ich keinen Nerv hatte die Kamera anzuschließen.

  • Hallo Peter,


    prima Schnitte und tolle Bilder zeigst du uns da - vielen Dank! :daumen:


    PEG (Polyethylenglycol) ist für solche Schnitte - auch bei Pilzen - sehr gut geeignet. Keine Sorge, auch für Mikrotomschnittte ist PEG eine gute Alternative zu Paraffin. Die Blöckchen halten viele Jahre, solange sie nicht mit Wasser in Berührung kommen. Ich persönlich nehme lieber PEG 400 und setze einen Tropfen Glycerin zu. Das verbessert die Schneidfähigkeit enorm.


    Ich weiß leider nicht, was LCB ist (irgendwas mit Baumwollblau?). Da muss man wohl selbst versuchen, welche Färbezeiten sinnvoll sind.


    So schöne Schnitte sind es wert, als Dauerpräparat konserviert zu werden. Der Aufwand ist nicht sehr groß und man hat auch nach Jahren noch etwas davon.


    Freundliche Grüße

    Noch so'n Peter

  • Hallo Peter.


    PEG400? Meinst Du ggf. 4000? Mein PEG400 (das ich zum experimentieren geholt habe) ist flüssig.


    LCB ist Lactophenol mit Baumwollblau. Ich werde experimentieren und berichten.

    Mit Dauerpräparaten Fange ich an wenn ich konsistent mit meiner Schnittqualität zufrieden bin.


    Nächster Schritt sind diverse Protokolle zur Schnelleinbettung. Bin nicht immer der Geduldige, und wenn wir es schaffen kleine Gewebeproben innerhalb 3h in Paraffin auf gefärbt unters Mikroskop zu bekommen sollte es mit kleinen Flechtenproben auch klappen.


    Peter, der andere.

  • Hallo Peter,


    du hast natürlich Recht, PEG 4000 ist gemeint. Da kommt es tatsächlich mal auf eine Null an.


    Meine Erfahrungen mit Baumwollblau (in Lactophenol, Milchsäure, oder auch Wasser) sind, dass die Färbung nur kurze Zeit braucht, abhängig von der Dicke der Objekte. Auf zusätzliches Erwärmen verzichte ich.

    Wenn ich mal wieder ein frisches Fläschchen öffne, kann es sein, dass ich wieder eine erste Versuchsreihe starten muss. Eventuell ist die Konzentration nicht immer die gleiche.


    Freundliche Grüße

    Peter

  • Hallo Peters, danke für die Anregung, an Ostern habe ich eine Flechte gefunden an der ich das gerne mal probieren möchte. Ich habe herausgefunden, dass ein gebräuchliches Abführmittel, das unter dem pharmazeutischen Namen „Makrogol“ vertrieben wird aus PEG 3350 besteht. Man bekommt es für 7-10 Euro rezeptfrei in der Apotheke.


    und setze einen Tropfen Glycerin zu

    wann machst du das? Ich hatte geplant das Pulver über einer Flamme zu schmelzen und dann ein Tröpfchen Glycerin zuzugeben? Oder löst du PEG in Wasser, setzt dann Glycerin zu und lässt das dann wieder eintrocknen? Ich möchte keinen Block gießen, nur ein Thallusstück am OT befestigen, damit es beim Schneiden nicht wegrutscht.

    Das hatte ich bereits mit Parafin (Teelicht) versucht. Der Schnitt ist damals gut gelungen, leider hat man die Paraffin Bläschen im Präparat, wenn man nicht mit zB Xylol wäscht (war mir wegen Toxizität zu aufwändig, hab nur eine Küche, kein Labor)

    Hier erhoffe ich mir einen Vorteil durch PEG was ja mit Wasser auswaschbar sein sollte.

    Ich werde gerne berichten, auch wenn der Versuch scheitert.

    Viele Grüße Ingo

  • Hallo Ingo,


    Glycerin setze ich nur zu, wenn ich Blöckchen gießen will. Das hilft sehr beim Schneiden, damit das PEG nicht bröckelt.



    Im Idealfall (tritt leider nicht ständig ein) bilden sich dann sogar Schnittbänder.


    Freundliche Grüße

    Peter

  • Hallo Peter, das ist natürlich sehr schick dein Mikrotom und wenn das dann auch noch so läuft wie am Schnürchen.. :)

    Ich muss nochmal nachhaken- du gibst also einen Tropfen Glycerin auf einen Block (3-5g?) flüssiges PEG 4000 und verrührst das dann? oder tropfst du das Glycerin auf den festen Block vor dem Schneiden sozusagen als "Rasiergel"?

    LG Ingo

  • Hallo Ingo,


    das Pilzfragment wird zunächst fixiert (damit sich die Zellen nicht mehr verändern).

    Dann kommt es in ein Gemisch ca. 1:10 PEG mit Wasser plus einem Tropfen Glycerin. Da verbleibt es einige Tage, bis das Wasser verdunstet ist. Dann ist das Fragment infiltiert.

    Ich bastele mir ein "Förmchen" (Becher) aus Alufolie. (Alufolie um einen Edding wickeln.)

    Frisches PEG (plus ein Tropfen Glycerin) wird erhitzt und ins Förmchen gegossen. Das infiltrierte Pilzfragment kommt mit in die heiße Flüssigkeit.

    Nach Erkalten (Kühlschrank) wird die Alufolie entfernt. Dann habe ich einen Zylinder mit eingeschlossenem Pilzstück.

    Der wird nach Durchhärten (Stunden bis Tage) aufs Mikrotom geklebt und ist bereit zum Schneiden.


    Beide mal, wenn PEG dabei ist, setze ich einen Tropfen Glycerin zu. Dessen Größe ist rein nach Gefühl bemessen.

    Zum Schneiden braucht es dann keinen Zusatz. Die Schnitte sollten wachsartig sein und nicht bröseln.


    Gruß

    Peter


    PS: Das "schicke" Mikrotom ist deutlich über 100 Jahre alt.

  • Hallo Peter, vielen Dank für Deine ausführliche Antwort! Genau das wollte ich wissen :thumbup:


    PS: Das "schicke" Mikrotom ist deutlich über 100 Jahre alt.

    Das sind ja auch manche schicke Mikroskope :)


    Edit: Moment- das bedeutet ja vermutlich aus der Robert Koch Zeit, das hätte ich dem Gerät nicht angesehen!

    Naja vielleicht findet mich ja auch mal eins..

    Viele Grüße Ingo

  • Hallo zusammen, ich möchte kurz über meine Erfahrung berichten.

    Danke Peter für den Tip PEG über Ebay zu kaufen, dort hatte ich auch geschaut aber nur größere Mengen gefunden von einem Anbieter aus Polen mit 8Euro Versandkosten. Nachdem ich noch nicht wusste ob das was für mich ist hab ich mich fürs Abführmittel entschieden, das konnte ich auf dem Arbeitsweg besorgen;)

    Ich wollte PEG testen als Schneidhilfe für das manuelle Schneiden kleiner Objekte. Ich wählte als Versuchsobjekt ca 0,5-1mm große Flechtenapothecien von Gyalecta jenensis.

    Ich habe dazu das Makrogol auf dem Herd auf niedrigster Stufe in einem kleinen selbstgebauten Alu Töpfchen (Danke Peter) erhitzt. Das Pulver schmilzt zu einer klaren Flüssigkeit, am Boden setzen sich die zugesetzen E'lyte ab.

    Dann habe ich einen Tropfen Gylcerin (hatte ich fürs Auto in der Garage) zugesetzt und mit einem Zahnstocher umgerührt.

    Von der flüssigen Masse habe ich etwas auf einen OT getropft und gewartet bis es beginnt sich wieder zu verfestigen. Dann habe ich mit einer Pinzette das Apothecium aufgesetzt und dann nochmals eine Schicht PEG darüber gegossen. Nach Erkalten (Gefrierfach 5min) begann ich mit dem Schneiden mit einer Rasierklinge. Das schien zunächst passabel zu gelingen, leider löste sich nach dem dritten Schnitt das PEG vom OT ab. Ich hielt es also fortan zwischen Daumen und Zeigefinger und nutzte den Nagel des Letzteren als Führung- das ging fast noch besser als auf dem OT. Das getrocknete Apothecium war allerdings deutlich härter als das PEG (in diesem Fall war ich froh das höhere Molgewicht gewält zu haben), was einen kräftigen Schnitt einem Zug verlangte.

    Die Schnitte rollten sich immer ein (Rama Effekt nenn' ich das mal zur Veranschaulichung). Das stellte sich allerdings als kein so großes Problem dar wie befürchtet, da sich die Rollen in Wasser zum Glück wieder relativ gut ausrollten ohne dass das Präparat brach. Das mag aber nicht mit jedem Objekt funktionieren.

    Ein Problem war allerdings die Orientierung- auch wenn ich versuchte den Schnitt möglichst orthogonal zur Apothecienoberfläche zu führen waren bei den meisten Schnitten die Asci und Paraphysen leicht schräg angeschnitten, was natürlich bedingte, dass die Sporen im Ascus nicht alle in einer Schärfeebene lagen.

    Ich habe die Schnitte direkt auf einen frischen OT mit einem Tropfen Wasser überführt. Das PEG löste sich alsbald auf und störte auch nicht beim Mikroskopieren. Ich habe es nicht vorher abgezogen. Allerdings sollte man das möglichweise vor dem Färben doch machen, ich stellte fest, dass sich mit Lugol braune Kristalle bildeten. (Das mag allerdings auch an Flechten- oder Algeninhaltstoffen gelegen haben, ich werde das mal beobachten).

    Als Resumee kann ich festhalten, dass das PEG meine Erwartungen hinsichtlich einer schnellen und (relativ) einfachen Möglichkeit ein sehr keines Objekt zum Schneiden zu befestigen ohne optische Einschränkungen beim Mikroskopieren in Kauf nehmen zu müssen erfüllt hat. Mit entsprechend größerem Aufwand (und Übung bei der Schnittführung) ist da sicherlich noch mehr drin, aber wie oben gesagt ging es mir um eine mögichst zeitsparende Methode.





    Peter (PBR), ich würde mich freuen über deine weiteren Erfahrungen zu lesen!


    Viele Grüße

    Ingo

  • Hallo zusammen,


    eine praktische Frage nach einigem herumexperimentieren mit PEG.


    Wie wascht ihr denn das PEG aus den schnitten aus? In situ auf dem OT? Von paraffinschnitten kenne ich das schwimmen lassen im Streckbad, bei mir geht alles was ich schneide direkt unter - wie ein Stein. Habe für mich noch keine befriedigende Lösung von Schnitt --> Präparat auf OT ohne PEG gefunden.


    Viele Grüße

    Peter

  • Hallo Peter, den untergegangenen Schnitt kann man mE. kaum ohne Beschädigung retten. Dass er untergeht wird wohl an der Hygroskopie desPEG liegen.

    Hast du den PEG Schnitt mal direkt auf auf den OT gelegt? Bei mir hat sich das mit einem Tropfen Wasser schnell verflüssigt. DG drauf und ggf noch etwas Wasser „durchziehen“.

    Vielleicht ha ja noch jemand eine bessere Idee.

    LG Ingo

  • Hallo,


    so wie Ingo das darstellt, geht das direkt auf dem Objektträger. Da kann mit Wasser öfters gespült werden.


    Ich selbst lege die Schnitte direkt ins Wasser einer Petrischale. Dort löst sich das PEG auf, dann übertrage ich den Schnitt mit einem feinen Pinsel auf den Objekträger. Wenn die Schnitte nicht zu dünn sind (20-30 µm ist prima), gibt es relativ wenig Ausschuss.


    Gruß

    Noch so'n Peter

  • Hallo Ingo, hallo Peter,


    danke für eure schnellen Antworten. Ich habe im Moment eine Parmelia (sowie ein Lebermoos, Metzgeria furcata) als Übungsobjekte. Ingos Vorschlag die (Hand) Schnitte direkt auf den OT zu legen ist im Moment die einzige Möglichkeite die ich sehe, ich hab aber immer wieder Reste von PEG (1500) - da ich offensichtlich beim spülen auf dem OT zu ungeduldig bin.


    Peters Antwort entnehme ich, dass Aufschwimmen wohl doch geht - das wäre eigentlich die Methode die ich vorziehen würde.

    In der grauen Literatur lese ich auch immer wieder, dass die Schnitte zuerst auf 10% PEG gegeben werden sollen damit sie beim auslösen des PEG nicht zerreißen. Das wäre ja auch eher eine Sache zum "schwimmen lassen".


    Ich werde es weiter versuchen und berichten.


    Peter (der andere)